Антитела. Методы. Книга 1 - Кэтти Д.
ISBN 5-03-002363-1
Скачать (прямая ссылка):
кювете. Полностью погружают гель в раствор красителя для белка не менее
чем на 1 ч.
2. Переносят гель в раствор для отмывания красителя и •оставляют его на
ночь до полного удаления фонового окрашивания. Усилить окраску можно
методом серебрения с помощью специальных материалов (см. приложение). Это
особенно целесообразно в тех случаях, когда исходная концентрация белка
была низкой, а также для выявления полос небольших белковых включений.
3. Для высушивания гель помещают на гладкую поверхность полиэтиленовой
пленки и накрывают фильтровальной бумагой. Затем высушивают. Для
предотвращения образования складок высушенные гели хранят под грузом,
например между страницами книги.
Описанный выше метод применяется для разделения экстрагированных
бактериальных и паразитарных антигенов, а также компонентов сыворотки
человека. Он позволяет получать хорошие полосы белков с мол. массой от
150 до 10 кДа. Для ограничения этого диапазона можно изменить
концентрации акриламида. Известны наборы для приготовления минигелей (см.
приложение). В них входят специальные кассеты для заливки гелей. Они
более экономичны с точки зрения расхода реагентов и требуют меньше
времени, но одновременно снижается разрешающая способность при разделении
очень сложных смесей. Компромисс состоит в использовании минигелей с
различными концентрациями акриламида. Рис. 2.4 иллюстрирует разрешающую
способность 14%-ного геля шириной 14 см при разделении экстрагированных
из мембран и разрушенных белков Е. coli и микобактерий. Последние служат
исходным материалом для получения как моноклональных антител, так и
кроличьей полиепецифической антисыворотки. Белки Е. coli получают
следующим образом [27].
1. 250 мл культуры Е. coli в середине логарифмической ¦фазы роста
центрифугируют (10 000 g, 10 мин, 4°С) и осадок дэесуспендируют в 25 мл
ледяного PBS (50 мМ, pH 7,4). Затем
Получение поликлональных антител и контроль их качества
63-
центрифугируют снова и осадок ресуспендируют в 2 мл PBS, содержащего 140
мМ 2-меркаптоэтанола, в небольшом флаконе.
2. Взвесь обрабатывают ультразвуком (ультразвуковой дезинтегратор W
380 фирмы Life Science Lab.) на льду при максимальной мощности (380 Вт),
применяя наконечник диаметром 1 см - 8 циклов по 30 с охлаждением взвеси
на льду между циклами.
*штш\
*пмц§.
"ЯШ'-
шшшк
****">"
Ij-gMiin.
12 3*56
7 8 9 Ю 1112
Рис. 2.4. Разделение экстрактов мембран Е. coli, М. bovis (БЦЖ) и М.
tuberculosis с помощью ДСН-ЭПАГ (14%-ный восстанавливающий гель).
Пластины окрашены для выявления белков. Дорожки: 1, 6 и 12 - маркеры мол.
массы; 2-5 - белкн внутренней и наружной мембран Е. coli\ 7-8 и 9-11-
мембранные антигены и цельный растворимый экстракт соответственно М.
tuber--
culosis и М. bovis БЦЖ
3. Гомогенат центрифугируют (10 ООО g, 10 мин, 4°С) и супернатант
ультрацентрифугируют (100 000 g-, 1 ч, 4°С), предварительно охладив
ротор. Супернатант образует цитозоль.
4. Осадок ресуспендируют в 1 мл PBS (без 2-меркаптоэтанола) и вновь
центрифугируют (10000g, 30 мин, 4°С). Осадок, ресуспендируют в 100 мкл
PBS.
5. Через 30 мин при комнатной температуре добавляют 10 мкл 20%-ного (вес
на объем) сархозила (N-лаурилсаркози-нат натрия) для растворения
мембранных белков. Смесь ультрацентрифугируют (lOOOOOg', 30 мин, Ю°С).
Супернатант
64
Глава 2
представляет собой белки внутренней мембраны, осадок - белки наружной. На
рис. 2.5 приведен пример анализа чистоты иммуногена с помощью ДСН-ЭПАГ.
4. Получение адъювантов для иммунизации
4.1. Водно-масляные эмульсии
4.1.1. Неполный адъювант Фрейнда (НАФ)
Масляную фазу получают, добавляя 35% (объем на объем) эмульгатора
Арлацела А (моноолеата маннита) к Байо-лу F - легкому парафиновому маслу.
Компоненты тщательно перемешивают и хранят при 4°С.
.'-J. 9 3 4 5 61 89
Рис. 2.5. Применение ДСН-ЭПАГ для определения чистоты иммуногена.
Дорожки: 3 и 6 - маркеры мол. массы; 1 - мембранный экстракт БЦЖ; 4 -
антиген БЦЖ 65 кДа; 5 - цельная сыворотка человека; 7-легкие цепи
иммуноглобулинов; 8 - тяжелые цепи IgG. Очищенный антиген БЦЖ любезно
предоставлен д-ром Coulson из Национального института медицинских
исследований, Милл Хилл, Лондон; субъединицы иммуноглобулинов-д-ром
М. Walker
I. Оборудование, необходимое для получения эмульсии иммуногена.
2-мл градуированные пипетки с плотной грушей
5-мл стеклянный флакон (bijou)
1-2 стеклянных шприца с замком Люэра со смазанными вазелином поршнями.
Игла № 20 с двумя канюлями или тефлоновые двухконечные адаптеры для
шприца (см. приложение)
50-мл мензурка с водопроводной водой
1-2-мл стеклянные шприцы для инъекций с поршнями, смазанными вазелином
Получение поликлональных антител н контроль их качества
65
Инъекционные иглы.
II. Методика.
1. Определяют необходимый общий объем эмульсии в соответствии с видом и
количеством животных и способом введения; увеличивают этот объем на 20% в
расчете на потери.
2. Переносят необходимый объем адъюванта во флакон.
