Антитела. Методы. Книга 1 - Кэтти Д.
ISBN 5-03-002363-1
Скачать (прямая ссылка):
5.2.2. Воспроизведение метода
Ниже описана рекомендуемая методика, модифицированная по [18].
1. Стерильно берут кровь барана в равный объем раствора Олсвера. На
протяжении всей процедуры строго соблюдают стерильность.
2. Собранную кровь перемешивают, чтобы ресуспендиро-вать клетки, и
переносят в стерильную пробирку с крышкой. Добавляют стерильный ФР, снова
закрывают пробирку крышкой, перемешивают содержимое и центрифугируют при
700 g в настольной центрифуге 10 мин. Удаляют супернатант и пленку
лейкоцитов, образующуюся на поверхности. Эритроциты отмывают еще 5 раз
стерильным ФР (700g, >5 мин), каждый раз как можно тщательнее удаляя
супернатант и 'пленку. В пробирке не должно наблюдаться следов лизиса. По
окончании отмывания снова ресуспендируют клетки в ФР и осаждают их
центрифугированием при 1100 g в течение 10 мин.
3. Полностью удаляют супернатант, затем, слегка встряхивая пробирку,
разбивают клеточный осадок. Набирают определенный объем клеточной
суспензии в градуированную пи-
17-997
258
Глава 7
петку (на 2 или 5 мл) и переносят в .стеклянный флакон, содержащий 9
объемов стерильного ФР, Таким образом получают 10°/о-ную суспензию
эритроцитов. Хорошо перемешивают ее и переносят аликвоты объемом 1 дол в
надписанные стерильные стеклянные пробирки (75X13 мм) с крышками.
4. Когда все готово для процедуры связывания, осаждают эритроциты
центрифугированием и удаляют супернатант. Добавляют определенный объем
раствора белка, предназначенного для связывания с эритроцитами, во все
пробирки, приготовив последовательные разведения антигена. Концентрация
белка может составлять 1-3 мг/мл, а количество добавленного антигена в
ряду разведений - 0,05-0,3 мг. Количество белка, равное 0,3 мг,
представляет собой избыток и обычно дает результат, слегка превышающий
таковой с 0,1 мг белка. Примерный нижний предел определения составляет
0,05 дог.
5. Каждую пробирку последовательно помещают на смеситель Вортекс.
Добавляют необходимое количество хлорного хрома (0,4-1,2 мл, см. разд.
5.2.3, п. 5) и быстро перемешивают содержимое пробирок. (Осторожно
смывают реакционную смесь со стенок каждой пробирки, осторожно вливая 1
мл стерильного ФР.
6. Закрытые крышками пробирки оставляют на ночь. На следующий день в
каждую пробирку добавляют по 2 мл среды H-RPMI и перемешивают
еодержидоое. Осаждают эритроциты центрифугированием, удаляют супернатант
и ресуопен-дируют клетки в 4 мл среды H-RPMI. Хранят при 4°С. Перед
использованием в титровании суспензию эритроцитов разбавляют в
соотношении 1: 5 средой H-RPM1 - 2% СПК
5.2.3. Технические замечания
1. Белки, 'предназначенные для связывания с эритроцитами, могут быть
получены путем обычного солевого фракционирования и хроматографическими
методами, однако перед использование'м их необходимо диализовать против
ФР. Далее раствор, подвергают высокоскоростному центрифугированию (11 000
g) или фильтруют через стерильную ме^мбрану "Miilipore" и затем по
поглощению при 280 нм (А28о) рассчитывают концентрацию белка в растворе.
Небольшие аликвоты раствора помещают в маленькие стерильные пробирки,
которые хранят на холоду (обычно при -20 °С). Поскольку все белки в
равной степени связываются с зритроцитами, желательно использовать
очищенный белок. Однако обычно не возникает необходимости в получении
абсолютно чистого белка.
2. Хлорный хром. Исходный раствор готовят, растворяя 500 мг СгС1з-6Н20 в
500 мл ФР. СгС1з постепенно гидролизу-
Гемагглютинация и реакции антителозависимого гемолиза
259
ется с образованием комплекса ионов хрома, причем значение рн раствора
понижается. Еженедельно, в течение нескольких недель, pH раствора
необходимо доводить до 5,0, добавляя по •каплям 1 М NaOH. Нейтрализация
сопровождается измене* нием окраски раствора с бледно-голубой на слабо-
зеленую. Примерно через "месяц хранения и периодической нейтрализации
значение pH становится относительно постоянным; лишь иногда необходимо
добавление капли 1 М NaOH для нейтрализации. Такой раствор считается
"созревшим", он готов к употреблению. Перед использованием хлорный хром
разбавляют ФР в 10 раз до конечной концентрации 0,1 мг/мл.
3. Физиологический раствор. Необходимое условие - это удаление из
раствора фосфатов, ацетатов, белков и других инородных примесей,
поскольку они ингибируют процесс связывания. Эритроциты, хлорный хром и
белковые антигены необходимо готовить на ФР. Стерильный ФР можно
приготовить автоклавированием в бутылях из твердого стекла (мягк'ое
стекло выделяет щелочь) или фильтрованием через соответствующие мембраны.
4. Большинство белков, 'предназначенных для связывания с эритроцитами,
лучше хранить в виде аликвот при -20 °С или - 70 °С. Однако некоторые
белки (например, IgM) лучше хранить при 4°С, поскольку при замораживании
они денатурируются.
5. Количество хлорного хрома, необходимое для связывания, обычно зависит
от конкретного препарата белка. Предварительно целесообразно использовать
