Высокоэффективная жидкостная хроматография в биохимии - Хеншен А.
ISBN 5-03-001337-7
Скачать (прямая ссылка):
т
I
t.MHH
12
t.MHH
t мин
Рис. 5.2. Хроматограмма, полученная при разделении (D-His2)-ТРФ и ТРФ
методом ВЭЖХ [50].
Колонка: 300X4 мм (внутр. диа-
метр); неподвижная фаза; ц-бонда-пак Cte; элюент: 0,5% CH3CN/0,0I М.
NH4OAc (pH 4,0); объемная скорость: 3 мл/мин; обнаружение: при 210 нм;
проба: 50 мкг ТРФ+0,36 мкг (0,7%) (D-His*)-TP<J>.
Рис. 5.3. Хроматограммы, полученные при
разделении водных растворов ТРФ [52]. Колонка: 300X3,9 мм (внутр.
днаметр); неподвижная фаза: для анализа жирных кислот (10 мкм); элюент:
60%-ный метанол в 0,1%-ной уксусной кислоте; объемная скорость: 1,5
мл/мин; обнаружение: прн 215 нм.
а - свежеприготовленный раствор, б - тот же раствор после хранения в
течение 27 сут прн 4 °С.
На рис. 5.6 изображена схематическая диаграмма препаративной системы
ВЭЖХ для препаративного разделения синтетического тиреолиберина и его
аналогов на сильнокислотном ионообменнике при элюировании летучим
элюентом. В системе использован буфер на основе пиридина и уксусной
кислоты, который поступает на стеклянную термостатированную высоко-
Таблица 5.8. Сравнение технических характеристик аналитических и
препаративных колонок для ВЭЖХ
Характеристики колонки Аналитическая Препаративная
колонка колонка
Длина колонки, см От 20 до 25 50
Диаметр колонки (внутренний), мм От 3,5 до 4,5 От 8 до 20
Количество носителя От 2 до 3 От 20 до 150
Объемная скорость, мл/мин От 1 до 2 От 5 до 20
н
JOh
C0HN-4^,C0№
H
CONH,
CH,
CH
Рис. 5.4. Структура пироглутамил-Ь-гнстидил-3,3-диметилпролинамнда.
Рис. 5.5. Хроматограмма, полученная при разделении L-пироглута-мил-Ь-
гистидил-Ь-3,3-диметилпро-лннамнда и его изомеров [58]. Колонка: 250X4,6
мм (внутр. диаметр); неподвижная фаза: сферисорб CN
(5 мкм); элюент: а - ацетоинт-
рил/0,01 мМ ацетат натрия (30:70); объемная скорость: 2 мл/мии, 6 - аце-
тоннтрил/0,01 ыМ ацетат меди (30 : 70): объемная скорость; 0,5 мл/мин;
обнаружение: по поглощению при 210 нм.
1 - L-L-D; 2 - L-D-L; 3 - L-L-L; •# - D-L-L-изомер.
t, мин
Ввод
Микронасос
Реакционный термостат
(кипящая
Самописец Фотометр \1------------------------------'вола!
(570нм) Слиз
Рис. 5.6. Схема пептидного анализатора, осиащеииого ионообменной колонкой
[69].
А- Г - резервуары для буфера: Д - резервуар для воды; F. - резервуар для
щелочн (5 М NaOH); Ж - резервуар ДЛЯ реагента нннгндрин/уксусная кислота.
Пептидные гормоны 283
tr
Рис. 5.7. Хроматограмма реакционной смеси, полученной в результате 2-
часовой обработки BoK-Phe-Glu(OBz)-Pro-NH2 кипящей ТФУ [69].
Колонка: 550X9 мм (внутр. диаметр); неподвижная фаза: катиоиообменная
смола DC-1A, 18±3 мкм (дуррум, Пало-Альто, шт. Калифорния, США); элюент
(см. текст и подпись к рис. 5.6): буфер - пирнднн/уксусная кислота. А-
0,2 М пнридни. pH 3,4 (60 мин), В - 0,5 М пиридин, pH 4,25 (120 мин), В -
1,0 М пиридин" pH 6,0 (120 мин), Г - 4,0 М пиридин, pH 5,6 (180 мин);
температура: 45 °С, давление: от 80 до 96 бар; объемная скорость; 1.5
мл/мнн: деление потока элюата; 1 :22=4,4% пробы расходуется иа
обнаружение; сплошная лииия: обнаружение после частичного гидролиза,
введено пробы 166 мг, собрано после разделения на фракции 155 мг;
штриховая линия: обнаружение без частичного гидролиза, введено пробы 109
мг.
2 - Phe, Glu, Pro (1,8 мг); 3- Phe, Glu, Pro (2,3 мг); 4- Phe,
Glu, Pro (9,3 мг);
5-Glu; 6 - Phe. Glu (108 Mr); 7 - Phe, Glu, Pro (17,4 мг); 8 - Phe
(30,5 мг); 9 -
Phe, Glu, Pro (13,8 мг); 10 - Phe, Glu. Pro (16,4 мг); - Phe,
Glu, Pro (7,2 мг);
1'J - Phe. Pro (2,7 мг); 13 - Phe. Pro (4,2 Mr); 14 - Phe, Pro (11.1
мг): 15 - Phe. Glu,
Pro (6,5 мг); 16 - Phe, Glu, Pro (17,9 мг); 17 - Phe, Glu, Pro (31 мг);
/8-Phe (5,1 мг); 19, 20 - аминокислота отсутствует.
эффективную колонку (550X9 мм) фирмы Biotronic, заполненную
катионообменной смолой DC-1A.
Небольшой объем элюата (5%) гидролизуется 5 М раствором NaOH в
тефлоновой петле (20 мХ0,7 мм) при 100 °С. Аминокислоты в гидролизате
обнаруживаются с использованием нингидринового реагента, 95% элюата
поступает в коллектор фракций. Эта система ВЭЖХ позволила успешно
осуществить очистку синтетических аналогов рилизинг-фактора тиреолибе-
рина из мультикомпонентных смесей. На хроматограмме (рис. 5.7) видно
больше число соединений, образующихся при реакции 01и2-трипептидов с
кипящей трифторуксусной кислотой (ТФУ). Нет ничего удивительного в том,
что при взаимодействии BoK-Phe-Glu(OBzl)Pro-NH2 с кипящей ТФУ образуется
реакционная смесь, из которой невозможно выделить ни один из чистых
продуктов путем кристаллизации. Пептидный анали-
284 Глава 5
Рис. 5.8. Хроматограмма, полученная при препаративном разделении ТРФ и
