Высокоэффективная жидкостная хроматография в биохимии - Хеншен А.
ISBN 5-03-001337-7
Скачать (прямая ссылка):
нестабильности неподвижной фазы [16]. Более прочное связывание более
крупных пептидов и полистирол-ди-винилбензольной матрицы затрудняет их
очистку этим методом [17]. С момента разработки двухколоночной системы
[18] в области разделения аминокислот и пептидов были достигнуты
значительные успехи. В частности, разработан одноколоночный метод
разделения, получили распространение стабильные смолы с малым размером
частиц и новые реакции синтеза производных аминокислот и пептидов для их
обнаружения.
Разделение и обнаружение аминокислот и пептидных гормонов на
пикомольном уровне можно осуществлять при помощи модифицированного
коммерчески доступного хроматографа, оснащенного автоматической системой
формирования градиента, колонкой с ионообменной смолой с малым размером
частиц (от 5 до 8 мкм) и системой обнаружения на основе реакции с
флуорескамином [19].
На рис. 5.1 изображена функциональная диаграмма автоматического
аминокислотного анализатора, работающего по методу ВЭЖХ с использованием
флуорескамина в качестве реагента для обнаружения. Элюирование ведется в
градиентном режиме с применением двух цитратных буферов (pH 2,6 и 6,3;
Пептидные гормоны
265
Флуорескамин
15'30м|/мл
Ацетон
Кран
50%-ная
H2S04
Тройник<
петля 50 см * 0,25 мм
ЬтШ1ПР-[Флуори1и. pinnmr^
само-
писец
Слив!
Рис. 5.1. Функциональная диаграмма автоматического ВЭЖХ-анализатора
аминокислот, пептидов и пептидных гормонов (для обнаружения компонентов
смеси используется реакция с флуорескамином) [19].
0,2 и 1,2 М по Na+). Поступающий из колонки элюат смешивается с боратным
буфером до достижения pH 9,0 (оптимальное значение pH), обеспечивающего
максимальную флуоресценцию [19].
Фталевый альдегид в присутствии 2-меркаптоэтанола взаимодействует с
первичными аминогруппами аминокислот, пептидов и пептидных гормонов с
образованием флуоресцирующих производных. Однако для повышения
чувствительности метода обнаружения необходима десятикратная по сравнению
с первоначально предложенной Ротом [20, 21] концентрация 2-мер-
каптоэтанола [22]. По сравнению с флуорескамином фталевый
266 Глава 5
альдегид имеет два преимущества: он в пять - десять раз более
чувствителен, чем флуорескамин, и растворим в водных системах [22-24].
5.2.3. Ион-парная высокоэффективная жидкостная хроматография
Метод разделения аминокислот, пептидов и пептидных гормонов на обращенных
фазах с применением "парных ионов" [25-28] имеет целый ряд названий,
например: катионообменный метод с использованием детергентов [29], ион-
парная хроматография [30, 31], мыльная хроматография [27], ионообменная
хроматография, генерируемая растворителем [32], сольватофобно-ион-ная
хроматография [33], хроматография с использованием поверхностно-активных
веществ [34]. Рядом авторов предложены различные механизмы удерживания
соединений на колонках, в том числе сольватофобный [25, 35, 36] и
ионообменный [33, 37, 38]. Тем не менее динамическое равновесие,
вероятнее всего, регулируется электростатическими, элюофильными, элюофоб-
ными, адсорбофильными и адсорбофобными силами.
Алкилсульфонаты и фосфат додециламмония [39, 40], добавляемые в
подвижную фазу в концентрации от 0,05 до 5 ммоль/л, - это традиционные
для ион-парной хроматографии поверхностно-активные ионы [41-43]. По
данным авторов работы [36], зависимость коэффициента емкости k для
полярных молекул от концентрации парного иона описывается следующим
уравнением:
k = (*" + р[Х] (1 + k2lX\ )-К1 + ?3Ш)-') (1)
где ko - коэффициент емкости в отсутствие противоиона X и р, k<i и къ -
соответствующие равновесные константы ассоциации.
Если ОФ-ВЭЖХ пептидных гормонов дает размытые пики, низкие выходы
разделяемых соединений или плохое разрешение, ион-парная хроматография
позволяет исправить положение, как это продемонстрировали авторы работы
[44] на примере разделения тиреолиберина (фактор высвобождения либерина,
или тиреолюберин), вещества Р, аргинин-вазопрессина и энке-фалинов [44].
5.3. Разделение пептидных гормонов методом ВЭЖХ
5.3.1. Гормоны гипоталамуса
Гипоталамус представляет собой центр нейросекреторной деятельности нашего
тела. В областях nucleus supraopticus и nucleus paraveutricularis
образуются окситоцин и вазопрес-син, а биосинтез нейросекреторных
регуляторных гормонов
Пептидные гормоны 267
Таблица 5.4. Названия, структура и регуляторный эффект рилизинг-факторов
гипоталамуса [46, 47]
Название
Структура (предполагае Регуляторный
согласно номен мая) эффект
традиционное клатуре ИЮПАК
Кортикотропина Кортиколи- Ac-Ser-Tyr-Cys-Phe-His- Образование
рилизинг-фак- берин (Asn, QIn)-Cys(Pro, ACTHa
тор VaI)-Lys-GIy-NH2
