Генетика популяций - Хедрик Ф.
ISBN 5-94836-007-5
Скачать (прямая ссылка):
Для детального знакомства с методами определения изменчивости ДНК читатель может обратиться к специальной литературе (Avise, 1994; Hills et al., 1996; Hoelzel, 1998). Один из таких широко используемых методов основан на расщеплении ДНК бактериальными ферментами - эндонуклеазами рестрикции, узнающими специфические сайты в молекуле ДНК. С помощью этих ферментов бактерии расщепляют чужеродную ДНК бактериофагов, в то время как их собственный геном защищен от действия этих ферментов с помощью метилирования нуклеотидов. Фермент EcoRI, например, впервые обнаруженный у кишечной палочки Escherichia coli, узнает следующие последовательности в двойной цепи ДНК: GAATTC/ CTTAAG, расщепляя их таким образом, что остаются неспаренные концы ААТТ.
Ферменты рестрикции используются для идентификации митохондриальной ДНК (мт ДНК). Эта ДНК представляет собой небольшие кольцевые молекулы (у человека это молекулы размером 16 569 нуклеотидов), которые содержат около 16 генов, наследующихся по материнскому типу. Количество фрагментов, полученных после расщепления кольцевой мтДНК ферментами рестрикции равно количеству сайтов узнавания для этих ферментов. Молекулы мтДНК достаточно велики, и также велика вероятность появления различающихся сайтов рестрикции у особей одного и того же вида и у разных видов. У человека, например, EcoRI узнает в мтДНК три сайта рестрикции, а в мтДНК медоносной пчелы -пять сайтов (Hillis et al., 1996). Отдельные особи и целые популяции могут различаться по разным сайтам рестрикции ДНК, а это приводит к полиморфизму длин рестрикционных фрагментов, или ПДРФ. Анализ сайтов рестрикции важен для оценки взаимосвязей между близко родственными группами, поскольку накопление новых сайтов рестрикции происходит довольно быстро. Кроме того, считается, что четырех- или шестичленные последовательности, узнаваемые ферментами рестрикции, вероятно не подвержены отбору. Поэтому каждый из таких сайтов уникален и появляется в популяции только однажды.
У 87 особей сумчатой крысы Geomys pinetis, обитающей на юго-вос-токе США, было исследовано 6 различных сайтов рестрикции в мтДНК и обнаружено 23 различных гаплотипа (рисунок 1.8), (Avise et al., 1979). Число различий между сайтами рестрикции в разных гаплотипах отмечено поперечными черточками: например, гаплотип р отличается от гаплотипа q по одному сайту, а гаплотип р от г - по двум. Очевидно, что существует строгое соответствие между близостью гаплотипов и их географической локализацией, т.е. в соседних популяциях обнаруживаются сходные гаплотипы. Исключением является распределение сайтов рестрикции между западными и восточными популяциями.
Рисунок 1.8. Взаимосвязь между 23 различными гаплотипами мтДНК у 87 сумчатых крыс (по Avise et al., 1979).
Диаграмма, связывающая наиболее близкие гаплотипы, наложена на карту географического расселения животных. Вертикальные черточки указывают на число возможных различий между гаплотипами.
В 1977 году появился метод секвенирования ДНК. При секвенирова-нии ДНК вручную реакционную смесь помещают в 4 пробирки, в каждой из которой определяют порядок расположения в молекуле ДНК только одного из нуклеотидов. На рисунке 1.9 показан пример секвенирования последовательности размером 59 нуклеотидных пар (аллель МНС у пигмеев племени Джила (Gila); Hedrick, Parker, 1998а) с помощью авторадиографии по методу Сэнджера (Sanger et al., 1977). Данная последовательность читается снизу вверх как TACGCCCGGT.........С помощью таблицы
1.1 и замещения Т на U можно получить соответствующую аминокислот-
—J*
Ж
<йвг
• .
'ЗЙР
Рисунок 1.9. Радиоавтограф секвенирующего геля. На разных дорожках показано наличие каждого из четырех нуклеотидов. Просеквенирована последовательность аллеля Роос-6 МНС, полученного от пигмеев Джила (Hedrick, Parker, 1998а), которая читается снизу вверх.
иую последовательность в виде: YARFDS. В последнее время широко используется метод автоматического секвенирования, а секвенирование вручную применяется все реже.
Графическое изображение той же последовательности размером 59 нуклеотидных пар (н.п.), полученное при автоматическом секвенирова-нии показано на рисунке 1.10. Все четыре реакции секвенирования протекают в одном геле и представлены в виде пиков. Эти пики разного цвета соответствуют разным нуклеотидам, а самый высокий пик в каждой из позиции указывает на локализацию данного нуклеотида в определенном сайте последовательности. Последние достижения ДНК-технологии позволяют получать с помощью специальных чипов одновременно 500 однонуклеотидных полиморфизмов, или SNPs (single nucleotide polymorphisms), (Wang et al., 1998). Показано, что примерно один из ты-
Т ACQCCCQ QTTTQACAQCAACCTQQAQAAATATQTTQQATACACQQAQTTTQQAQTQAA
Рисунок 1.10. Электрофореграмма автоматического секвенирования. Пики в разных позициях обозначают наличие разных нуклеотидов в оригинале, отмеченных различными цветами. Просеквенирована та же последовательность, что и на рисунке 1.9.
