Растровая электронная микроскопия и рентгеновский микроанализ. Том 1 - Гоулдстей Дж.
Скачать (прямая ссылка):
Рис. 11.12. Схема биокамеры AMRAY для получения излома в замороженном
состоянии [302].
/ - колонна РЭМ; 2 - охлаждаемая пластина; 3 - охлаждающий элемент Джоуля
- Томпсона; 4 - жидкий азот; 5 - изолирующий клапан; 6 - установка ножа
по высоте; 7 - перемещение ножа; 8 - увеличение ХЮ-100; 9 - охлаждаемый
экран; 10 - металлический источник; // - угольный источник; 12 - модуль
для панссеиия покрытия; 13 - модуль для смены образца; /'/ - держатель
образца; 15 - коллимирующая диафрагма; 16 - вакуумный клапан; /7 -
держатель с возвратно-поступательным перемещением; /8-стержень управления
держателем; 19 - рычаг наклона вращения; 20 - нить нагревателя; 2/- блок
загрузки и нанесения покрытия; 22 - салазки перемещения блока; 23 -
вакуумный насос; 24 - жалюзи, охлаждаемые жидким азотом.
238
Глава 11
Рис. 51.13. rioHep.NHi.icTH излома замороженных в гидратированном
состоянии кончиков корня Lenina minor.
Корни были инкапсулированы либо в 25%-ном поливикилпирролидонс (в), либо
в 25%-ном оксиэтиловом ксилэтиловом крахмале (л, б, г) и быстро
заморожены в кипящем азоте. Замороженные корни переносились в жидком
азспс в биокамеру AMRAY, где про-изводились излом, травление и иаиесенпе
пленки золота толщиной 20 им при 103 К и давлении 50-10~6 Па.
Замороженные образцы изучались при 93 К и давлении 20П0-6 Па в РЭМ AMR
1000 А. На снимке а показано кольцо, состоящее из восьми клеток лубяной
паренхимы, окружающих центральную клетку ксилемы. Метка соответствует 10
мкм. На снимке б показаны полностью замороженные наружные клетки
корневого чехлика. на которых отсутствуют повреждения за счет кристаллов
льда. Метка соответствует 20 мкм. На снимке в показано кольцо, состоящее
из клеток лубяной паренхимы с одной клеткой, выделенной в трубке сита, и
соседней клеткой. Маркер составляет 10 мкм. На снимке г видно "ядро из
трубки сита. Метка составляет 5 мкм.
Вообще говоря, излом в замороженном состоянии наиболее просто производить
на материале животного, а не растительного происхождения из-за более
однородной плотности мягкого материала и наличия целлюлозных и
одревесневших стенок клеток в растительном материале, приводящих к более
быстрому расщеплению растительного материала и создающих весьма
нерегулярные поверхности излома.
В работе [302] описано очень сложное оборудование (рис. 11.12), которое
является приставкой к микроскопу и позволяет неоднократно делать изломы
замороженных в гидратированном состоянии образцов, наносить покрытие и
наблюдать при низких температурах в микроскопе. С помощью этого при-
Препарирование биологических объектов для РЭМ
239
бора были получены взаимодополняющие реплики с дрожжей с разрешением 10-
15 нм [302] при использовании метода замораживания- скалывания. Совсем
недавно этот прибор был использован для исследования поверхностей излома,
высушенных в замороженном состоянии развивающихся корней Lemna minor
[303]. Разрешение достаточно высоко и можно наблюдать субклеточные
органеллы и перегородки внутри клеток видоизменяющейся лубяной паренхимы
(рис. 11.13). Поверхности излома обычно исследуются в РЭМ
непосредственно, хотя возможно также проводить исследование на
изготовленных из теплочувствительного материала репликах, на которые
предварительно наносится покрытие.
11.3.5.3. Изготовление реплик
В недавно опубликованной работе [345] дается подробное ¦описание большого
числа методов получения реплик, пригодных для изучения естественных
наружных поверхностей, как показано на рис. 11.14, где проводится
сравнение исходной поверхности и реплики. Реплики могут быть также
изготовлены с внутренних поверхностей путем инфильтрации органа пластиком
с низкой вязкостью и его полимеризации, после чего ткань удаляется,
оставляя чистый отпечаток поверхностей. Такие реплики особенно полезны
для интерпретации областей с большой внутренней поверхностью, таких, как
легкие или почки, и для исследования микрососудистой системы многих
органов [346- 348]. На рис. 11.15 показаны детали капиллярной сети
ворсинок, полученной при использовании латексного метода, описанного в
[346]. Использовался также метилметакрилат; в работе [349] это вещество
использовалось для получения подробных отпечатков микрососудов яичника
крысы. В работе [350] была введена модификация метилметакрнлатовой среды,
в которую был добавлен пластик с низкой вязкостью (Serviton), в
результате чего получилась смесь, примерно в 10 раз менее вязкая, чем
метилметакрилат. Используя эту смесь, авторы получили стабильные
отпечатки микрососудов желудочно-кишечного тракта ряда животных. Попытки
использовать методы получения реплик с последующим химическим
растворением биоматериала растительной ткани не увенчались успехом, по-
видимому, за счет того, что растения не обладают механизмом пропускания
жидкостей сквозь их структуру.
11.3.6. Локализованные области с известной физиологической активностью
Объем биологического материала состоит из элементов с низким атомным
