Растровая электронная микроскопия и рентгеновский микроанализ. Том 1 - Гоулдстей Дж.
Скачать (прямая ссылка):
образцов микропункцией и определения элементного состава и концентрации
жидкостей в объеме всего лишь в несколько пиколитров. В разработанных
методах [396-398] маленькие капли помещают на очень хорошо отполированную
поверхность бериллия, погруженного в ванну с вазелиновым маслом. Капли
воды не смешиваются с гидрофобным вазелиновым маслом и остаются в виде
отдельных капель на бериллиевой подложке.
Вазелиновое масло удаляется с помощью ксилола или хлороформа, а капли
высушиваются в замороженном состоянии, оставляя нелетучий материал в
микрокристаллической форме. За одно и то же время могут быть обработаны
сотни образцов, поскольку поверхность бериллиевого блока размечается с
помощью сетки для облегчения идентификации образцов. Лешен с сотр.
автоматизировали многие из аналитических методик, и в настоящее время
этот метод является одновременно точным и воспроизводимым. Несколько
отличающийся способ был недавно описан в [399, 400], в котором микрокапли
наносятся на тонкую пленку-подложку из парлодия и высушиваются не
лиофильной сушкой, а выпариванием при вспышке. Метод микрокапель был
распространен на анализ органических образцов путем осаждения очень малых
количеств мочевины с помощью тиоксантена-9-ол, а затем произведения
анализа осадка на се-РУ [401].
Препарирование биологических образцов для РМА
27Э
12.1.4.5. Толстые срезы
Толстые срезы (т. е. между 0,2 и 2,0 мкм) являются полез-ным
компромиссом, поскольку при использовании растровых изображений на
просвет может быть получена достаточно хорошая морфологическая
информация, а образцы являются довольно толстыми и содержат достаточное
количество материала, который можно проанализировать с хорошим
пространственным разрешением. Поскольку большинство растительных и
животных тканей являются очень мягкими, перед изготовлением срезов их
прежде всего нужно стабилизировать и упрочнить. Как будет обсуждаться
ниже, большинство из этих способов препарирования может привести к
серьезным потерям из тканей растворимых субстанций и должно
использоваться с большой осторожностью. Альтернативный путь - производить
анализ срезов, высушенных лиофильной сушкой или замороженных в
гидратированном состоянии.
12.1.4.6. Тонкие срезы
На тонких срезах толщиной менее 200 нм обычно обнаруживается огромное
количество морфологических деталей, и им потенциально присуще самое
высокое пространственное разрешение в режиме рентгеновского микроанализа.
Однако за счет их малой толщины количество анализируемого материала может
уменьшиться до очень низкого уровня вследствие малости микрообъема
исследуемого среза. Тем не менее исследователь сталкивается с теми же
проблемами препарирования, которые существуют при препарировании толстых
срезов, . и единственную заметную помощь дает использование тонких срезов
материала, который подвергался лиофильной сушке или замораживанию
замещением.
Преимущества и недостатки различных типов образцов подытожены в недавно
опубликованной статье по визуализации объектов [402]. Визуализация
объекта является важной особенностью рентгеновского микроанализа,
поскольку зонд необходимо точно устанавливать на клетках и/или тканях.
12.1.5. Стратегия
Прежде чем предпринимать любую попытку препарирования образца, необходимо
четко уяснить ответы на пять пунктов:
1) тип исследования, 2) степень сложности анализа, 3) тип
оборудования, 4) тип визуализации образца и 5) природа объекта. Например,
нужен совершенно другой подход к препарированию объекта для качественного
анализа ковалентно связанного элемента в образце, представляющем собой
биопсию печени, с помощью растрового электронного микроскопа, работающего
в ре-
274
Глава 12
жиме на отражение, со спектрометром с дисперсией по энергии и для
количественного анализа способных диффундировать ионов в тонком срезе
корня растения с помощью рентгеновского микроанализатора, работающего на
просвет, с кристалл-диф-ракционными спектрометрами. Следует сделать
перечень этих пяти параметров, и, уточнив условия проведения анализа,
исследователь должен решать, какие из методов препарирования образца
являются оптимальными.
\
12.1.6. Положения, которым нужно следовать
для достижения удовлетворительного препарирования объекта
Существует ряд положений, которые должны выполняться при применении
методов препарирования для биологического микроанализа. В работе [403]
предложено пять таких положений:
1) Необходимо, сохранять адекватными нормальные структурные взаимосвязи
объекта. Трудно установить пределы сохранения морфологии, но хорошим
требованием было бы достижение морфологического пространственного
разрешения по величине на порядок лучше, чем ожидаемое пространственное
разрешение в режиме рентгеновского микроанализа.
2) Необходимо знать количество утраченного или приобретенного образцом
материала. Это может быть достигнуто при выполнении объемного химического
анализа на одной половине идентичного объекта до препарирования. Хотя
