Электрофорез в разделении биологических макромолекул - Гааль Э.
Скачать (прямая ссылка):
[268] (рис. 126). Если после электрофореза полирибосом в комбинированном полиакриламидно-агарозном геле проводить во втором направлении электрофорез в присутствии ЭДТА или ДСН, то можно определить состав рибосомных субчастиц и РНК в каждой анализируемой популяции полирибосом. Дальберг и др. [1267] рекомендуют для разделения субчастиц рибосом применять 3%-ный полиакриламидный гель, содержащий. 0,5% агарозы.
Таленс и др. [1273, 1274] провели очень чувствительный анализ субчастиц рибосом Е. coli в полиакриламидном геле (4% Т, 5% С) при pH 7,6. Каждый из мономеров рибосом и обе субчастицы были разделены на три субфракции, которые, вероятно, представляли собой конформационные изомеры или агрегаты.
рис. 126. Сравнение электрофоретических подвижностей контрольных и обработанных стрептомицином препаратов полисом [268]. 1 — контрольные полирибосомы; 2 — полирибосомы из клеток Е. coli, обработанных стрептомицином; 30S и 50S — малая и большая субчастицы рибосом; 70S — мономерные рибосомы; 2Х—5Х — полирибосомы, содержащие от 2 до 5 рибосом. Обратите внимание на измененную электрофоретическую подвижность полирибосом, обработанных стрептомицином.
деления вирусных частиц [177] частиц, полученных из рибосом ми [170].
Эти изомеры РНП-час-тиц нельзя было разделить путем ультрацентрифугирования или с помощью электрофореза в средах, не обладающих свойств ам и imo л еку л я р -
ного сита.
Миро и др. [876] применили для разделения 50S- и 555-предшественников рибосом из клеток HeLa электрофорез в полиакриламидном геле (2,7% Т или градиент 2—6%). Для изучения компактности и заряда м и тохон д р и а л ь н ых
рибосом также был использован градиент концентрации полиакриламидного геля [295]. При проведении электрофореза в градиенте концентрации акриламида определение его концентрации, при которой прекращается миграция РНП-частиц, дает информацию о размерах этих частиц, а скорость миграции отражает величину их заряда.
Полиакриламидные и комбинированные поли-акриламидно - агарозные гели применяли для вы-и для фракционирования РНП-при расщеплении их нуклеаза-
IV. ЭЛЕКТРОФОРЕТИЧЕСКОЕ РАЗДЕЛЕНИЕ ГЛИКОЗАМИНОГЛИКАНОВ
ЭЛЕКТРОФОРЕТИЧЕСКИЕ СИСТЕМЫ
Гликозаминогликаны — это полимеры различных производных сахаров, содержащие отрицательно заряженные карбоксильные и сульфатные группы. Молекулярная масса гликозаминоглика-нов может достигать многих сотен тысяч дальтон, поэтому подробное описание их электрофоретического разделения представляет несомненный интерес.
Как правило, для выделения гликозаминогликанов ткань подвергают действию протеолитических ферментов, а затем гликозаминогликаны осаждают солями алифатических аммониевых оснований (чаще всего хлористым цетилпиридинием) или этанолом (иногда тем и другим одновременно) или же выделяют их с помощью хроматографии [46, 47, 397, 427, 582, 1157, 1302].
Для электрофоретического разделения гликозаминогликанов разработано несколько систем, в которых в качестве поддерживающей среды используются фильтровальная бумага, ацетат целлюлозы, агарозный или полиакриламидный гель. В 1953 г. Риниц [1090] описал электрофоретическое разделение гиалу-роновой кислоты и хондроитинсульфатов на фильтровальной бумаге в натрий-фосфатном буфере (pH 6,7). Харуки и Кирк [521] отделили хондроитинсульфат В от хондроинтинсульфа-тов А и С путем электрофореза на бумаге в растворах сульфата или ацетата цинка. В настоящее время наилучшее разделение гликозаминогликанов дает электрофорез на полосках ацетата целлюлозы в следующих системах растворителей:
1) 0,48 М муравьиная кислота — 0,1 М пиридин (pH 3,0) [831];
2) 0,1 М натрий-фосфатный буфер (pH 6,7) [1090];
3) натрий-вероналовый буфер (pH 8,6; ц — 0,1) [1409];
4) 0,2 М бутиламин [587];
5) 0,1 М НС1 [1410];
6) 0,1 М ацетат бария [1409];
7) 0,1 М ацетат цинка [1039];
8) 0,1 М ацетат меди;
9) 0,1 М ацетат лантана [524];
10) 0,1—0,3 М ацетат кальция [1167].
Таблица 10
Подвижность (мм) гликозаминогликанов на полосках ацетата целлюлозы в различных буферных системах [426]
Гликозаминогликан Цитрат натрия, Ацетат цинка, Муравьиная
0,1 М, pH 3,5 0,15 М, pH 6,0 кислота --- пи
ридин pH 3,0
Гиалуроновая кислота 39 37,5 45
Хондроитинсульфат В 47 41 52
Кератансульфат 47 43 56
Хондроитинсульфаты А и С 51 47,5 59
Гепарин 59 47,5 59
В системах 1—5 подвижность гликозаминогликанов определяется суммарным зарядом молекул. Поскольку в 0,1 М НС1 глюкуроновая кислота находится в недиссоциированной форме, электрофоретическая подвижность гликозаминогликанов зависит от содержания в них сульфата. С другой стороны, в 0,2 М растворе бутиламина аминогруппы полностью диссоциированы, следовательно, в такой системе подвижность гликозаминогликанов определяется суммарным количеством анионных групп.
