Электрофорез в разделении биологических макромолекул - Гааль Э.
Скачать (прямая ссылка):
Очень важной проблемой является также обнаружение фрагментов иммуноглобулинов, выделяемых с мочой при злокачественной трансформации иммуноцитов. Фрагменты иммуногло-
булинов в моче (белки Бенс-Джонса, белки «болезни тяжелых цепей») можно идентифицировать путем иммуноэлектрофореза с соответствующими моноспецифическими антисыворотками.
Вайзе и Бокхорн [1393] применили методику микродиск-электрофореза для анализа белков мочи у больных после пересадки почки. Количественное определение альбумина в моче они проводили на микроденситометре. При острых реакциях отторжения в моче резко возрастает содержание альбумина и обнаруживаются измеримые количества других белков.
II.7.10. Белки молока
Белки коровьего молока изучены более подробно, чем белки женского молока. Содержание белков в коровьем молоке значительно выше, чем в женском (3,5 и 1,0% соответственно). Основную массу белков коровьего молока составляет фракция казенное, тогда как в женском молоке на эту фракцию приходится менее половины общего количества белков. Казенны представляют собой фосфопротеиды, которые свертываются под действием ренина. Простейший способ выделения казеинов из обезжиренного молока состоит в подкислении его до pH 4,6. При этом значении pH большинство казеинов выпадает в осадок при комнатной температуре, в растворе же остается молочная сыворотка, содержащая около 0,6% белка. Описано много других способов выделения казеинов и их препаративного фракционирования (см. обзор Мак-Кензи [853]).
Еще в 1939 г. Мелландер [860] путем электрофореза с подвижной границей разделил казенны крупного рогатого скота на три фракции а, р и у, В последующих исследованиях было показано, что фракция а-казеинов состоит из белков двух типов, один из которых называется as-казеином от англ. sensitive— чувствительный к осаждению ионами Са2+), а другой — х-казеином. В 1961 г. Уэйк и Болдуин [1365] применили для анализа казеинов электрофорез в крахмальном геле в неоднородной буферной системе Паулика [1028], содержавшей 7 М мочевину. Под действием мочевины нековалентные внутримолекулярные связи в казеинах разрушались и последние разделялись на многочисленные зоны. Эти же авторы ввели систему идентификации компонентов казеина путем расчета их подвижностей относительно четко выраженной зоны в области as-казеина. При разделении казеинов по методу Уэйка и Болдуина рядом с зоной х-казеинов, но ближе к катоду появляется широкая диффузная зона, маскирующая минорные компоненты. Если в буфер геля включен 2-меркаптоэтанол, то а-казеины мигрируют в виде четкой зоны (или зон) [1133].
При электрофорезе в щелочном геле в отсутствие 2-меркап-тоэтанола наиболее быстро мигрирующий класс казеинов, as-ка-зеины, разделяется на 6 зон [41, 900]. Основная зона (cts.i-ка-зеин) проявляет генетически детерминированный полиморфизм. В ней можно различить продукты четырех кодоминантных аллелей аутосомного гена [1286, 1287]. Генетически детерминированные варианты A, D, В и С обозначают как as.i-казеин А, as i-казеин D, as.i-казеин В и as.i-казеин С (перечислены в порядке снижения их электрофоретической подвижности). При добавлении в буфер геля 2-меркаптоэтанола разделение as-ка-зеинов на зоны несколько изменяется. Тома и Накаи [1295] доказали, что as,5-казеин является в действительности комплексом as.3- и cts.4-казеинов, связанных дисульфидными мостиками.
При щелочных значениях pH можно различить четыре генетически, детерминированных варианта |3-казеина: А, В, С и D [1286]. При низких значениях pH р-казеин А разделяется на подтипы А1, А2 и А3 [674], тогда как р-казеин В и р-казеин D дают только одну полосу.
С помощью электрофореза в крахмальном геле с меркапто-этанолом и мочевиной выявлен также генетически детерминированный полиморфизм и-казеина. Были обнаружены два варианта этого компонента (А и В) [1133].
Методы электрофореза в крахмальном геле по Ашаффенбур-гу и Тиману [63] позволяют проводить определение фенотипов as.r, Р- и к-казеинов в одном и том же образце. Усовершенствование этой методики [62] дало возможность различать также и варианты р-лактоглобулина, если электрофорезу подвергать не казеиновую фракцию, а суммарные белки молока. Электрофорез проводят на горизонтально расположенной пластинке (17,5X9X0,15 см) в тонком слое геля при 4°С и относительно высоком напряжении. Буфер геля содержит 6,4 М мочевину и 0,04 М 2-меркаптоэтанол (pH 8,6). Кислая буферная система для геля, предложенная Ашаффенбургом [58] (для обнаружения вариантов р-казеина А), содержит 4 М мочевину и имеет pH 1,7.
Электрофорез в полиакриламидном геле впервые применил для разделения казеинов Петерсон [996], описавший разделение as- и р-казеинов. Гроувс и Кидди [489] с помощью электрофореза в 7,2%-ном полиакриламидном геле (pH 8,9), содержавшем 4 М мочевину, изучали у-казеины и обнаружили два варианта этого белка (А и В). При электрофорезе суммарной фракции казеинов удается различить помимо ^-казеинов варианты р- и as.i-казеинов, а также некоторые минорные компоненты. Использование 5,75%-ного полиакриламидного геля в ацетатном буфере (pH 4,5), содержавшем 8 М мочевину, позво-
