Электрофорез в разделении биологических макромолекул - Гааль Э.
Скачать (прямая ссылка):
геназа
Изоцитратдегидрогеназа
Липоамиддегидрогеназа
Малатдегидрогеназа
Оксоглутаратдегидрогеназа
Фосфоглюконатдегидрогеназа
Сорбитолдегидрогеназа
Тиаминдегидрогеназа
UDP-глюкозодегидрогеназа
Этиловый спирт
2-бутанол
м-Оксибензиловый спирт Гликолевый альдегид. Дигидрооротат 4,5-дигидроурацил L-фукоза
Г люкозо-6-фосфат
Глутаминовая кислота Г лицеральдегид-3-фосфат
Г алактозо-6-фосфат
Гистидинол
L-гомосерин
Р-Гидроксибутират-
а- или р-гидроксистерои^ ды
5а-прегнан-20р-ол^3-он
Изоцитрат
Липоамид
Малат
а-Оксоглутарат
6-фосфоглюконат
Сорбит
Тиамин
UDP-глюкоза
219, 1006, 1208}' 476]
393]
12921
1190]
504]
1123]
22, 260, 1173]
[22, 247, 747, 754Jf [221]
[1173]
36, 254]
9371
747]
[1110]
[134]
11, 22, 615]
606]
425, 478, 1145]’ 972]
1038]
221]
905 *275
Ряд других ферментов выявляют после электрофореза путем сочетания реакции, катализируемой исследуемым ферментом, с действием специфической дегидрогеназы. Так, например, глице-ролкиназу можно обнаружить, используя инкубационную смесь, содержащую субстраты глицеролкиназы (глицерин и АТФ), a-L-глицеролфосфат—дегидрогеназу (в качестве вспомогательного ¦фермента),-NAD, ФМС и НТС. В зонах, содержащих глицерол-киназу, образуется a-L-глицеролфосфат, который здесь же подвергается дальнейшему превращению под действием вспомогательного фермента. Эта реакция сопровождается образованием •формазана |[530].
В некоторых случаях для обнаружения того или иного фермента с помощью дегидрогеназы приходится вводить еще один дополнительный фермент. Так, например, креатинкиназу выявляют в следующей цепи реакций:
ADP —*- АТР Креатинфосфат----------*- Креатин,
Креатинкиназа
АТР —ADP
Глюкоза ---------->* Глюкозо-6-фосфат,
Гексокиназа
NADP —> NADPH2 Глюкозо-б'фосфат -----------------------6-фосфоглюконат.
Глюкозо-6-фосфат—дегидрогеназа
Зона, в которой происходит восстановление NADP становится видимой либо вследствие реакции, приводящей к образованию формазана [1475], либо в результате флуоресценции восстановленного кофермента [1211].
Во многих методиках вспомогательные ферменты просто добавляют к инкубационной среде. Можно также использовать «индикаторный гель», содержащий вспомогательный фермент (или ферменты). Еще один способ применения вспомогательного фермента описал Харрисон [518]. Для обнаружения после электрофореза в полиакриламидном геле гексокиназы, глюкозо-фосфатизомеразы и фосфоглюкомутазы к гелеобразующему раствору перед полимеризацией акриламида добавляют глюкозо-6-фосфат — дегидрогеназу. В результате вспомогательный фермент оказывается равномерно распределенным в геле и иммобилизованным благодаря возникновению ковалентных связей с матриксом. При этом он сохраняет способность катализировать превращение глюкозо-б-фосфата, образующегося под действием указанных выше ферментов. Таким образом, при инкубации геля в среде, содержащей NADP, ФМС и соль тетразолия, в местах локализации разделенных ферментов появляется формазан.
Во время полимеризации акриламида может происходить некоторая инактивация фермента, поэтому рекомендуется применять условия, способствующие более быстрому застыванию
Обнаружение ферментов с использованием дегидрогеназ в качестве вспомогательных ферментов
Определяемый
фермент
Аконитаза.
Альдолаза
Аденилаткиназа
Аланинамино-
трансфераза
Аргининэстераза
Аргининкиназа
L-аспарагиназа
Креатинфосфоки-наза Г алактокиназа Галактозо-1-фосфат— уридил-трансфераза а-Галактозидаза
Глюкозофосфати-
зомераза
L-глутаматдекар-
боксилаза
Субстрат
Вспомогательный фермент
Источник
данных
Глиоксалаза
Гексокиназа
II
Фосфофруктоки-
наза
Фосфоглюко-
мутаза
Фосфоглицерат-
киназа
Пируваткиназа
Цитрат
Фруктозо-1,6-дифосфат
ADP, NADP
Оксоглутарат
Этиловый эфир N-a-бензоил-Ь-аргинииа
Аспарагин
Креатинфосфат,
ADP
Галактоза, АТР
Галактозо-1-фосфат, UDP-галактоза
Г алактозил- (a 1 -4)
Галактозил-(Р1-4)
Г люкозилцерамид
Глюкозофосфат
L-глутаминовая
кислота
Метилглиоксаль
Глюкоза, АТР
Фруктозо-6-
фосфат
Г люкозо-1 -фосфат
3-фосфоглицерино-вая кислота Фосфоенолпируват
Изоцитратдегидрогеназа Глидеральдегид-З-фосфат — дегидрогеназа Триозофосфатизомераза, ¦глицерофосфатдегидроге-наза или глицеральдегид
3-фосфат—дегидрогеназа Гексокиназа, глюкозо-6-фос фат — дегидрогеназа Глутаматдегидрогеназа
Алкогольдегидрогеназа
Пируваткиназа, лактатде-гидрогеназа Аспартатаминотрансфераза, оксалацетатдегидрогеназа Гексокиназа, глюкозо-6-фосфат — дегидрогеназа Пируваткиназа, ЛДГ Фосфоглюкомутаза, глюко-зо-6-фосфат — дегидрогеназа Г алактозодегидрогеназа
Глюкозо-6-фосфат — дегидрогеназа Трансаминаза у"аминомас-ляной кислоты, сукцинат-дегидрогеназа Глиоксалаза I, ЛДГ Глюкозо-6-фосфат — дегидрогеназа
