Электрофорез в разделении биологических макромолекул - Гааль Э.
Скачать (прямая ссылка):
Белки на бумажных электрофореграммах обычно фиксируют, высушивая последние при 100—120 °С, а затем бумагу погружают на 10 мин в ванночку с раствором, содержащем не более 1% красителя. Грассманн и Ханниг [468] предложили использовать насыщенный раствор амидового черного в смеси, состоящей из 9 частей метанола и 1 части уксусной кислоты. Обесцвечивание фона на электрофореграммах осуществляют, промывая их несколько раз той же смесью метанола и уксусной кислоты. Таким же способом обнаруживают белки и после электрофореза на ацетате целлюлозы, причем пленки можно сразу же погружать в раствор красителя; для окрашивания вполне достаточно 5 мин.
Гели можно окрашивать амидовым черным, растворенным в 7%-ном водном растворе уксусной кислоты; этот же растворитель используют и для обесцвечивания фона. Часто для окрашивания применяют растворитель, состоящий из воды, метанола и уксусной кислоты в соотношении 5:5:1 (объем/объем). В такой смеси происходит некоторая дегидратация полиакриламидных гелей, что приводит к их сжиманию. Оптимальное время окрашивания зависит от размеров и формы геля, а также от его концентрации. Окрашивание можно ускорить, повышая тем-
пературу раствора красителя. Неплохие результаты получаются при погружении гелей на 10 мин в нагретый до 96°С 1%-ный раствор амидового черного в 7%-ной уксусной кислоте. В этом случае фиксация разделенных зон происходит быстрее, поэтому окрашивание при повышенной температуре улучшает разрешение [1100]. Если после такого окрашивания обесцвечивание фона осуществляют путем электрофореза, то результаты электрофоретического разделения можно видеть уже через 30 мин после его окончания.
Для удаления избытка красителя применяют также многократное промывание гелей 7%-ной уксусной кислотой или описанным выше растворителем, содержащим метанол. В обесцвечивающем растворе гели сохраняются на протяжении многих месяцев без уменьшения интенсивности окраски.
При количественной оценке разделенных фракций, окрашенных амидовым черным 10 В, возникает ряд трудностей. Различные белки связывают неодинаковые количества красителя [1240], поэтому калибровочные кривые приходится строить для каждого компонента разделяемой смеси. При использовании бумаги в качестве носителя адсорбция красителя на волокнах целлюлозы может приводить к неравномерному окрашиванию зон и возникновению более высокого фона [330]. После электрофореза на пленках из ацетата целлюлозы были обнаружены отклонения от линейной зависимости между площадью пиков на денситограмме и количеством нанесенного белка [367]. В случае электрофореза в гелях площадь пиков на денситограмме зависит не только от количества нанесенных белков, но и от длины пройденного ими пути [283, 383] (см. рис. 71).
Другой способ количественной оценки разделенных белков состоит в элюции и фотометрическом измерении красителя, связанного с белковыми зонами. Амидовый черный можно элюировать 1 н. NaOH [1049]. Чтобы получать количественные данные, необходимо применять оптимальные и воспроизводимые методы окрашивания. Для количественного определения белков в полиакриламидных гелях можно использовать 0,01%-ный раствор амидового черного в 7%-ной уксусной кислоте [1048]. Окрашивание рекомендуется проводить в течение по меньшей мере 16 ч при постоянном перемешивании раствора. Амидовый черный представляет собой диазосоединение, молекула которого содержит две группы S03H, благодаря чему он обладает кислотными свойствами и связывается с положительно заряженными группами белков. Согласно экспериментальным данным [1048], 1 моль основных аминокислот связывает 0,56±0,06 моля амидового черного, что хорошо совпадает с вычисленной величиной, составляющей 0,5 моля. При окрашивании амидовым черным сильно основных белков могут образовываться полосы,
имеющие различные оттенки синего, черного и коричневатого цветов )[63б, 856]. Этот факт следует учитывать при выборе дл'ины волны, используемой при сканировании денситограмм, а также при построении калибровочных кривых для количественной оценки электрофореграмм.
Результаты количественного определения в большой степени зависят и от чистоты красителей. Метод их очистки описан Буссье [188J.
В 1963 г. Фазекас де Грот и др. |[367] предложили использовать для окрашивания белков после электрофореза на ацёта-те целлюлозы трифенилметановый краситель — кумасси яркий синий R-250 (синонимы: кислый голубой 83, супранолцианин 6В экстра, С. I. 42660). С тех пор этот краситель широко используется во многих видах электрофоретического разделения. Молекула кумасси яркого синего R-250 содержит две группы S03H и в слабо кислой среде- связывается с основными группами белков. В связывании принимают участие и вандерваальсовы силы. Белок и краситель образуют прочный комплекс, который, однако, полностью диссоциирует в результате разбавления раствора при соответствующих значениях pH [367].
Поскольку кумасси яркий синий, растворенный в метаноле, в равной степени окрашивает белки и ацетат целлюлозы, было предложено использовать его водный раствор по следующей методике 1[367]. Белки фиксируют, погружая электрофореграммы на 1 мин в водный раствор сульфосалициловой кислоты (200 г/л). Затем их без промывания переносят на 5 мин в раствор кумасси яркого синего (2,5 на 1 л дистиллированной воды). Следует применять воду, свободную от тяжелых металлов, так как они мешают удалению красителя, связанного с ацетатом целлюлозы. Для обесцвечивания фона электрофореграммы четыре раза по 5 мин промывают дистиллированной водой.
