Физическая биохимия - Фрайфелдер Д.
Скачать (прямая ссылка):
РИС. 5-6.
Доказательство самопоглощения.
Измеряемая радиоактивность непропорциональна прибавляемому объему. Пунктирная линия — радиоактивность, которая должна была бы быть при отсутствии самопоглощения; соотношение между сплошной кривой и штриховой линией дает эффективность (кривая обозначена светлыми кружками). Следовательно, если образец объемом 0,7 мл дает 4500 имп/мин, истинное значение составляет 4500/0,87 = 5184 имп/мин.
При использовании сдинтилляционных счетчиков образец в идеале должен быть растворен в Жидком сцинтилляторе, так как при этом достигается наилучший контакт каждого радиоактивного атома с растворителем. Если же образец нерастворим, он будет существовать в виде небольших частиц или агрегатов, и энергия некоторых р-частиц при прохождении через агрегаты будет понижаться, т. е. будет происходить самопоглощение. Как уже отмечалось выше, это не является серьезной проблемой для частиц с высокой энергией, но служит препятствием при определении 3Н. В общем случае растворимость имеет принципиальное значение при работе с биологическими объектами, поскольку используемые флуо'ресценты обычно растворимы только в неполярных растворителях, в которых биологические молекулы, как правило, нерастворимы.
Существует три основных метода приготовления биологических образцов для сцинтилляционных счетчиков: 1) сцинтилляци-онный растворитель выбирается таким, чтобы он позволял прибавлять водные растворы, причем растворенное вещество должно при этом оставаться в растворе; 2) нерастворимое вещество фи-
зическими или химическими методами превращается в растворимую форму; 3) нерастворимые вещества собираются на нитро-целлюлозных фильтрах, стеклянном волокне или бумажных фильтрах и затем высушиваются. Первые два метода приводят к появлению тушения. Методы решения этой проблемы описаны ниже. Третий метод является быстрым и удобным, но также вносит несколько проблем.
Выбор растворителя, смешиваемого с водой
Обычные сцинтилляционные жидкости, приготовленные на основе толуола, не смешиваются с водой. Сцинтилляторы на основе диоксана позволяют вводить в них до 29% воды, но диоксан менее эффективен при переносе энергии, чем толуол. Свойства ди-оксановых сцинтилляторов могут быть улучшены путем добавки нафталина для повышения эффективности и различных спиртов или простых эфиров для увеличения растворимости нафталина при добавлении воды. Один из самых распространенных сцинтилляторов на основе диоксана называют сцинтиллятором Брэя. В каждой системе добавки вызывают тушение, но обычно этим можно пренебречь, если измеряется относительное количество радиоактивности, поскольку тушение будет одним и тем же во всех образцах. Однако прибавление к образцу воды и растворенных в воде солей приводит к тушению, которое увеличивается по мере увеличения количества воды. Обычно воду или раствор прибавляют к каждому образцу таким образом, чтобы общее количество прибавляемого вещества было одним и тем же во всех образцах анализируемой серии. Другим вариантом может быть определение степени тушения в каждом образце, которое кратко будет описано ниже.
Средний пробег р-частиц, испускаемых 3Н, в воде составляет приблизительно 0,5 мкм. Следовательно, если бы осадок или нерастворимое вещество можно было бы подвергнуть диспергированию так, чтобы размер получаемых частиц был много меньше 0,5 мкм, потери за счет самопоглощения были бы малы. Это может быть осуществлено несколькими способами. Если добавлять тюверхностно-активное вещество, например тритон-ХЮО, или эмульгатор, например Cab—О—Sil, то в толуольный сцинтиллятор можно ввести до 10% воды. При этом образуется эмульсия с капельками воды размером не более 0,1 мкм. Другими эмульгирующими смесями являются PCS и Aquasol (New England Nuclear Corporation). Альтернативным методом является фильтрование образца через тонко измельченную диатомовую землю (целит, Johns-Manville Corporation) с последующим счетом ^без добавления эмульгатора. Следует отметить, что принцип действия последнего метода неясен.
Растворение образца
Кислые вещества, такие, как белки и полипептиды, кислые полисахариды и нуклеиновые кислоты, могут быть превращены в форму, растворимую в сцинтилляторе, в результате реакции с органическими основаниями. Важнейшие из таких оснований — ги-амин 10-Х-гидроксид и примен 81-R (высокомолекулярные четвертичный и первичный амины соответственно). Для веществ, меченных 14С, иногда применяют методику, заключающуюся в сжигании образца и улавливании радиоактивного СОг с помощью пропускания через гиамин. Нерастворимые соединения основного характера, такие, как ионы металлов, растворяют при обработке 2-этилкапроновой кислотой или кислыми диалкилфос-фатами. Большинство этих методов технически сложны и приводят к появлению значительного тушения.
Сорбция на мембранных фильтрах
Нерастворимые образцы обычно отфильтровывают или сушат на бумажных фильтрах — удобный способ удаления воды. Однако этот распространенный метод имеет два недостатка: 1) эффективность счета зависит от ориентации бумаги во флаконе счетчика (это связано с тем, что бумага светонепроницаема в сцин-тилляционных растворах и задерживает часть фотонов) и
