Физическая биохимия - Фрайфелдер Д.
Скачать (прямая ссылка):
ция, вероятно, включает связывание положительно и отрицательно заряженных групп. Анализ расположения зон на электронных микрофотографиях некоторых типов коллагена показывает, что молекула тропоколлагена может образовывать волокна типа «.голова к голове» и «голова к хвосту», причем стандартная структура агрегатов включает замещение одной четверти длины молекулы тропоколлагена следующей молекулой.
«Распластывание» по Кляйнигмидту с позитивным контрастированием и круговым напылением
Вероятно, наиболее эффектным методом приготовления образцов из разработанных за последние десять лет является методика Кляйншмидта, позволяющая наблюдать молекулы ДНК. Основными достоинствами метода служат отсутствие артефактов, происходящих при высушивании, и получение исключительно контрастного изображения. Эта методика в настоящее время применяется почти в каждой биохимической лаборатории, причем для овладения ею достаточно всего лишь несколько часов. Каплю раствора ДНК в 0,5—1,0 М ацетате аммония, содержащем 0,1 мг/мл цитохрома с, наносят на стеклянную пластинку таким образом, чтобы она стекала по пластинке на поверхность 0,15— 0,25 М ацетата аммония (рис. 3-14). Когда капля достигает поверхности, по поверхности начинает распространяться пленка денатурированного цитохрома с. Эта пленка содержит некоторое количество вытянутых молекул ДНК, связанных с толстым слоем {100—200 А) денатурированного цитохрома с. Если поверхности пленки денатурированного белка коснуться сеткой, то к ней прилипнет капля, содержащая часть пленки. Если сетку с прилипшей каплей погрузить в спирт, водная фаза будет удалена, а пленка плотно свяжется с пленкой-подложкой на сетке. Используемая в настоящее время методика включает предварительное позитивное контрастирование уранилацетатом; белок, адсорбированный ДНК, будет окрашиваться так же, как образующая фон пленка, однако избыток белка позволяет получить хороший контраст. Контраст еще более увеличивается (или создается, если не применялось окрашивание) при напылении металла (обычно платины) под очень малым углом при одновременном вращении образца. Поскольку ДНК в образце покрыта пленкой белка, металл будет накапливаться у комплекса ДНК — белок подобно тому, как у забора наметает сугроб снега, однако это происходит со всех сторон, так как образец при напылении вращается. В результате получается исключительный контраст (рис. 3-15). Этот метод можно использовать для определения длины ДНК, а также для установления, является ли она кольцевой или же сверхспира-лизованной. В некоторых условиях (обычно при добавлении к
РИС. 3-14.
Подготовка образца ДНК по методу Кляйншмидта.
А — капля стекает вниз и образует на поверхности воды пленку белка; Б —пленка распространяется по поверхности. Сетку прижимают к поверхности пленки так, чтобы пленка-подложка на сетке пришла в соприкосновение с пленкой белка; В — образец обезвоживают погружением в этанол, а затем окрашивают уранилацетатом; Г — на сетку при вращении под очень малым углом напыляют металл; Д — увеличенное изображение цепи ДНК, покрытой цитохромом с, окрашенной и подвергшейся напылению испаряющимся металлом. 1 — капля (ДНК + цитохром с 4-1,0 М ацетат аммония); 2 — стеклянная пластинка; 3— нижний слой (0,15 М ацетат аммония); 4 — пленка цитохрома с, содержащего ДНК; 5—сетка; 6 — этанол; 7— раствор уранилацетата в этаноле; 5—‘испаряющийся металл; 9 — цепи ДНК; 10 — пленка цитохрома с; 11 — пленка-подложка; J2 напыленные атомы металла; 13 — цитохром с с атомами урана.
растворам формамида, обладающего денатурирующим действием) одноцепочечные полинуклеотиды становятся вытянутыми и их легко можно увидеть. Одноцепочечные ДНК и РНК отличаются от нативной ДНК по их относительной тонкости и скрученности (рис. 3-15).
В одном из вариантов метода, диффузионном методе, пленка цитохрома с образуется на растворе ДНК, и молекулы ДНК диффундируют по направлению к пленке, прилипая к ней. Этот процесс требует большего времени, однако дает возможность работать с гораздо меньшими концентрациями ДНК.
РИС. 3-15.
Электронная микрофотография двухцепочечной (Л) и одноцепочечной (Б) ДНК, полученная методом Кляйншмидта. Обратите внимание, что одноцецо-чечная ДНК более извилистая, чем двухцепочечная.
РИС. 3-16.
А — электронная микрофотография гетеродуплекса фагов и %Ь22\ (фаг де-леции); ДНК денатурировали и ренатурировали. Б— штриховая линия, соответствует однотяжевой ДНК ЯЬ221. Точечная линия показывает однотяжевую ДНК Я+. Гетеродуплексная петля представляет собой часть Х+у отвечающую деледии ЯЬ221. (Любезно предоставил Мануэль Валенсуела.)
РИС. 3-17.
Электронная микрофотография ДНК с использованием хлорида бензалкония [метод описан в Proceedings of the National Academy of Sciences, 72, 83 (1975)].
Молекулы, полученные этим методом, выглядят тоньше, чем в случае методики Кляйн-шмидта. В результате хорошо видны молекулы связанного белка. На этой микрофотографии изображены три сферические молекулы РНК-полимеразы (указаны стрелками), связанные с ДНК фага Т7 Е. colL Ширина микрофотографии соответствует приблизительно 3 мкм. (Любезно предоставил Т. Коллер.)
