Физическая биохимия - Фрайфелдер Д.
Скачать (прямая ссылка):
г ПЧ ЮЬ Лй У-ЦМФ 105 С(В)Н I
950 *)00 В 1)0 НПО
Химический едина. Уц
только РИаза
РНаза + 0,002 М З'-ЦМФ РИаза +0,005 М 3-ЦМФ Plla:ia +0,010 М'З'ЦМФ РНала+ 0,030 М З'-ЦМФ
ООО
V
- 880
| 860 i
>< :
7 ВО
*•-------•
119
105
12
48
105
~Л___1 -1 _ 1_J________L__I_____L___
0,010 0,020 0,030 0,040
Б [З'-ЦМФ], М
РИС. 17-14.
А — фрагмент протонного спектра, на котором видны сигналы, соответствующие гистидиновым остаткам РНазы, при различных концентрациях добавленного З'-ЦМФ. Цифры относятся к определенному гистидиновому остатку. Б — график, построенный по данным части А. [Из работы Meadows D. Н., Jar-detzsky О., Ргос. Nat. Acad. Sci., 61, 406—413 (1968).]
Пример 17-В. Свойства активного центра рибониклеазы А. Структура активного центра панкреатической рибонуклеазы А была установлена путем изучения в спектрах ЯМР сигналов протонов в положении С-2 гистидиновых остатков при добавлении различных концентраций ингибитора — З'-цитидинмонофосфата (З'-ЦМФ), связывающегося с активным центром фермента, в определенном интервале значений pH. В этом ферменте имеется несколько гистидиновых остатков, но при добавлении З'-ЦМФ (рис. 17-14) значительно меняются сдвиги только трех из них
(12, 48 и 119)*, причем изменение сдвига гистидина-119 гораздо больше других. Ясно, что, когда добавляется З'-ЦМФ, каждый гистидин попадает в новое окружение. Проблема состоит в том, чтобы определить, какой гистидин участвует в прямом связывании с ингибитором. Изучение химического сдвига пика протона С-2 имидазола (ароматической части гистидина) как функции концентрации фосфата (т. е. используя имидазол вместо гистидина и фосфат — вместо З'-ЦМФ) показывает, что кривая зависимости химического сдвига имидазола от концентрации совпадает с аналогичной кривой для гистидина-119. Следовательно, наблюдаемый химический сдвиг протона С-2 гистидина-119 может быть результатом связывания последнего с фосфатной группой З'-ЦМФ (табл. 17-2, правило 7). Это можно проверить путем дальнейших исследований, используя ингибиторы 2'-ЦМФ и 5'-ЦМФ, константы связывания которых с рибонуклеазой отличаются. Химический сдвиг гистидина-12, как и зависимость этого сдвига от pH, одинаковы для комплексов с каждым из трех ингибиторов, даже несмотря на различие в связывании. Другими словами, гистидин-12 не несет ответственности за факторы, влияющие на связывание ингибиторов; можно предположить, что гистидин-12 не участвует в связывании фосфата. С другой стороны, и химические сдвиги, и pH связывания гистидина-119 различаются для комплексов с каждым из трех ингибиторов, т. е. гистидин-119 чувствителен к положению фосфата и поэтому, возможно, непосредственно с ним связывается. Однако изменения химических сдвигов для гистидина-12 достаточно велики, т. е. эта аминокислота, по-видимому, находится в активном центре или недалеко от него. Небольшое смещение сигнала протона С-2 в случае гистидина-48 является, вероятно, результатом конформационной перестройки белка, индуцируемой связыванием.
По соседству с гистидином-119 находится фенилаланин-120. Линии, которые дает этот остаток, не были однозначно идентифицированы; однако, так как в кольце Phe пять протонов и имеется пик соответствующей интенсивности в ароматической области спектра, можно допустить, что этот пик соответствует фенилаланину. При добавлении З'-ЦМФ положение этого пика сильно изменяется, но если добавить только фосфат, смещения не происходит. Это позволяет предположить, что связывание включает также взаимодействие между остатком цитозина в З'-ЦМФ и фенилаланином. Следует отметить, что это только предположение, потому что не ясно, принадлежит ли этот пик действительно фенилаланину-120.
* Эти цифры или другие обозначения: His-12, His-48 и т. п.— относятся к положению аминокислоты в полной аминокислотной последовательности белка.
РИС. 17-15.
Постулированная структура комплекса З'-ЦМФ и рибонуклсазы. [Из работы Meadows D. Н., Roberts G. С. КJardetzky О., I. Mol. Biol., 45, 491—511 (1969).]
При изучении спектра З'-ЦМФ можно получить дальнейшее доказательство участия цитозинового остатка в связывании (согласно правилу 7, табл. 17-2 спектры тех участков лиганда, которые вовлечены в связывание, должны тоже изменяться). Действительно, найдено, что связывание влияет на положение линий протонов цитозинового кольца, и сдвиги одинаковы для 2'-, З7- и 5'-ЦМФ. Это согласуется с идеей участия пиримидинового кольца в связывании, и, так как его связывание не чувствительно к положению фосфата, оно не связывается с гистидином-119.
На рис. 17-15 показана постулированная структура для комплекса с участием З'-ЦМФ. Хотя детали могут быть неверны, она дает представление о том, какие сложные выводы могут быть сделаны по данным ЯМР.
Пример 17-Г. Анализ характера связывания сульфанилаце-тамида с сывороточным альбумином быка (САБ) на основании спектра лиганда. Спектр сульфанилацетамида состоит из большого одиночного пика метильной группы и четырех близко расположенных пиков ароматического кольца. Когда добавляется
