Физическая биохимия - Фрайфелдер Д.
Скачать (прямая ссылка):
Основная цель изучения собственной флуоресценции белков— получение информации об их конформации. Возможность этого обусловлена тем, что как флуоресценция триптофана, так и флуоресценция тирозина существенно зависят от окружения (т. е. растворителя, pH, присутствия тушителя, малой молекулы или соседних групп в белке).
В основе использования измерений собственной флуоресценции белков лежат эмпирические «правила», полученные при изучении модельных соединений с хорошо известной структурой и конформацией. Обычно применяемые правила представлены в табл. 15.1. Следующие примеры иллюстрируют, как некоторые из этих правил используются на практике.
ТАБЛИЦА 15-1
Эмпирические правила для интерпретации спектров белков
1. Вся флуоресценция белка обусловлена наличием остатков триптофана, тирозина и фенилаланина, если известно, что белок не содержит особых флуоресцирующих компонентов
2. При уменьшении полярности растворителя ХМакс в спектре флуоресценции триптофана смещается в область более коротких длин волн и интенсивность при Хмакс возрастает;
а. Если Хмакс смещена в область более коротких длин волн, когда белок находится в полярном растворителе, триптофан должен находиться внутри молекулы в неполярном окружении3.
б. Если Хмакс смещена в область более коротких длин волн, когда белок находится в неполярной среде, то либо триптофан расположен на поверхности белка, либо он попадает на поверхность в результате конформационного перехода, индуцированного растворителем3
3. Если вещество, известное как тушитель (т. е. оно тушит флуоресценцию свободной аминокислоты), например иодид, нитрат или ионы цезия, тушит флуоресценцию триптофана или тирозина, то эти аминокислоты должны быть на поверхности белка. Если тушения не происходит, этому имеется несколько причин:
а. Аминокислота находится внутри молекулы.
б. Аминокислота находится в полости, размеры которой слишком малы, чтобы туда вошел тушитель.
в. Аминокислота находится в сильно заряженном участке, и заряд может отталкивать тушитель. Например, иодиду (отрицательнозаряженному тушителю) не удается потушить флуоресценцию триптофана, если триптофан находится в отрицательно заряженном участке; ион Cs+ неэффективен, если флуоресцирующий хромофор находится в положительно заряженном участке. Нейтральный тушитель, акриламид, безразличен к наличию заряда
4. Если вещество, которое не вдияет на квантовый выход свободной аминокислоты, действует на флуоресценцию белка, то оно делает это путем конфор-мационной перестройки белка
5. Если триптофан или тирозин находятся в полярном окружении, характерные для них величины Q понижаются при возрастании температуры 7\ тогда как в неполярном окружении изменения величин Q незначительны. Следовательно, отклонение от монотонного уменьшения Q с увеличением Т указывает на то, что нагревание индуцирует конфэрмационную перестройку, потому что полярность областей, где остатки триптофана были доступны, должна измениться. Параллельное возрастание величин Т и Q в условиях, когда белок находится в полярном растворителе, таком, как вода, указывает на то, что больше молекул триптофана стало доступно растворителю, и, следовательно, белок разворачивается
6. Q как триптофана, так и тирозина понижается, если ^-карбоксильная группа этих аминокислот протонирована
7. Флуоресценция триптофана тушится соседними протонодонорными группами. Следовательно, если р/(, измеренный путем контроля флуоресценции
триптофана, такой же, как рК известной, способной к ионизации группы (например, имидазола гистидина), то эта группа должна находиться очень близко от триптофана. Это правило применяется только в том случае, если можно независимо показать , что изменение pH не вызывает конформационных перестроек
8. Если при связывании какой-либо молекулы с белком тушится флуоресценция триптофана, то либо в результате связывания имеет место большая кон-формационная перестройка, либо часть триптофановых остатков находится в месте связывания или очень близко от него. Кроме того, понижение полярности растворителя приводит к смещению Амакс в область более коротких длин волн, и, следовательно, наличие такого смещения при связывании указывает на то, что вода исключается из комплекса
9. Если спектр поглощения малой молекулы перекрывает спектр испускания триптофана и расстояние между хромофорами невелико, имеет место тушение. Следовательно, если связывание такой молекулы с белком приводит к тушению флуоресценции триптофана, триптофан должен быть в месте ^связывания или недалеко от него
Примечание. При пользовании этими правилами необходимо иметь в виду два важных момента: 1) флуоресценция настолько чувствительна к факторам окружения, что необходимо всегда иметь в виду другую интерпретацию фактического материала, приведенного в этих правилах; 2) если в белке содержится несколько триптофановых остатков, как обычно и бывает, их квантовые выходы могут различаться. Следовательно, нельзя использовать абсолютную величину изменений флуоресценции для определения доли триптофановых остатков, находящихся в данном окружении, — например, отношения числа внутренних к числу внешних.
