Физическая биохимия - Фрайфелдер Д.
Скачать (прямая ссылка):
Параметры, измеряемые в абсорбционной спектроскопии
На рис. 14-6 показаны спектры, снятые в видимой и УФ-областях для двух биологических молекул. Обычно определяются величины D или е. Длина волны, соответствующая максимуму погло-
щения, называется Ямакс, и именно при этой длине волны обычно определяют е. Некоторые полосы поглощения состоят из многочисленных пиков, и часто регистрируют длины волн, соответствующие пикам, имеющим меньшие молярные коэффициенты погашения. Эти длины волн иногда также называют А,Макс или указывают, что вещество имеет максимумы поглощения при А,ь Яг, ... Яп-
Иногда измеряют ширину полосы, хотя и не обязательно.
В табл. 14-1 * приведен список величин ^-макс И Е хромофоров, часто встречающихся в биологических объектах.
ТАБЛИЦА 14-1
Максимумы поглощения Амакс и молярные коэффициенты погашения е
различных веществ при нейтральных значениях pH, используемых для биологических исследований
Соединение W’нм ? ПРИ Хмакс <Х1(Г,)
Триптофан3 280 5,6
219 47,0
Тирозин3 274 1,4
252 8,0
193 48,0
Фенилаланин3 257 0,2
206 9,3
188 60,0
Гистидин3 211 5,9
Цнстеин3 250 0,3
Аденин 260,5 13,4
Аденозин 259,5 14,9
Гуанин 246 10,7
Гуанозин 252,5 13,6
Цитозин 267 6,1
Цитидин 271 9,1
Урацил 259,5 8,2
Уридин 261,1 10,1
Тимин 264,5 7,9
Тимидин 267 9,7
ДНК 258 6,6
РНК 258 7,4
а Поглощение других аминокислот незначительно.
* Отметим, что длина золны выражается в нанометрах (нм). В более ранней литературе, а иногда и сейчас используют миллимикроны (ммк). Некоторые старые приборы прокалиброваны в ангстремах (А). 1 нм=1 ммк— = 10А= 10”9 м.
200 300 400 500 600 700
Длина волны, нм
Рис. 14-6.
Сравнение спектров поглощения двух биологических молекул: флавинмононуклеотида
(а) и фикоцианина (б). Спектры можно использовать для идентификации соединения.
Факторы, влияющие на абсорбционные свойства хромофора
Спектр поглощения хромофора определяется в первую очередь химической структурой молекулы. Однако ?1макс и е претерпевают заметные изменения и под влиянием окружения. Имеется в виду влияние pH, полярности растворителя или соседних молекул и относительная ориентация соседних хромофоров. Именно эти факторы лежат в основе использования абсорбционной спектроскопии для характеристики макромолекул.
Влияние окружения состоит в следующем.
Эффект pH. pH раствора определяет ионную форму ионизуемых хромофоров. На рис. 14-7 показан пример, иллюстрирующий влияние pH на спектр тирозина.
Эффект полярности. В случае полярных хромофоров часто справедливо (особенно если молекула содержит О, N или S), что Хмакс наблюдается при более коротких длинах волн в полярных растворителях, содержащих гидроксил (НгО, спиртах), чем в неполярных. Пример приведен на рис. 14-8.
Эффекты ориентации. Величины Хмакс и г существенно зависят от геометрических особенностей молекул. Наиболее известна гипохромия нуклеиновых кислот, т. е. понижение коэффициента погашения нуклеотида, при условии, что нуклеотид входит в состав одноцепочечного полинуклеотида, в котором нуклеиновые основания сближены и расположены друг над другом. Дальней-
РИС, 14-7.
Спектр поглощения тирозина при pH 6 и 13. Отметим, что, как Ямакс, так и е возрастают при диссоциации ОН-группы фенольного остатка.
Л, нм
РИС. 14-8.
Влияние полярности растворителя на спектр поглощения тирозина.
Растворители: вода (сплошная линия) и 20%-ный этиленгликоль (штриховая линия). Отчетливо видно
А, нм
РИС. 14-9.
Спектры поглощения ДНК фага Т7 в двухцепочечной (/) и одноцепочечной (2) формах, а также после гидролиза до свободных нуклеотидов (5), показывающие понижение оптической плотности (гипо-хромию), которое сопровождает образование более упорядоченной структуры. Спектры получены при одинаковой концентрации.
