Биологические мембраны - Финдлея Дж.Б.
ISBN 5-03-001317-2
Скачать (прямая ссылка):
Центрифугируют этот грубый экстракт при 30 000 g 30 мин.
3. Удаляют супернатант и ресуспендируют осадок в 400-500 мкл среды А (с
помощью маленького гомогенизатора Даунса). Разводят в 8 мл изоосмо-
тической суспензии перколла.
4. Готовят изоосмотическую суспензию перколла. взяв для этого перколл, 2
М сахарозу, 80 мМ трнс-НС1. 8 мМ ЭГТА, pH 7,4 (среда Б) и среду А в
отношении 7: 1 : 32 (по объему), чтобы получить плотность 1,05 г/мл.
Суспендируют 400 мкл грубой мембранной фракции в 8 мл этой суспензии.
5. Центрифугируют в угловом роторе при 10 000 g 15 мнн. Плазматические
мембраны концентрируются в верхней части градиента, хорошо отделяясь от
митохондрий, которые собираются у дна. Собирают материал с помощью шприца
и разводят в пять раз 10 мМ трис-НС1, 1 мМ ЭГТА, pH 7,4, содержащим 0,15
М NaCl (для плазматических мембран) или 0,25 М сахарозу (для
митохондрий).
6. Центрифугируют 25 мнн при 10 000 g, чтобы освободиться от гранул
перколла.
Б. Выделение зндосом и лизосом из макрофагов2>
Аналогичный метод применим для выделения эндосом из клеток в культуре31.
1. Получают альвеолярные макрофаги путем вымывания из легких кролика и
суспендируют их в растворе, содержащем 0,25 М сахарозу, 3 мМ нмидазол, pH
7,4 (среда А).
2. Гомогенизируют с помощью кавитации азота (разд. 2.2.1). Для этого
суспензию выдерживают под давлением 1,73 МПа в течение 10 мии.
3. Центрифугируют при 1000 g- 5 мин, собирают супернатант и
центрифугируют его при 17 000 об/мин 10 мин (ротор Beckman JA-17).
4. Ресуспендируют осадок в среде А (~2,5 мл).
5. Наслаивают на 30 мл суспензии перколла (плотность 1,07 г/мл) и
центрифугируют при 17 000 об/мин в течение часа (ротор Beckman JA-17).
Раскапывают градиент на фракции по 1 мл. Интересующий нас интервал
плотностей 1.02-1,12 г/мл; эндосомы имеют плотность 1,05 г/мл, а лизосомы
- 1,10 г/мл.
6. С помощью дифференциального центрифугирования удаляют перколл.
В. Выделение лизосом из почек4>
1. Измельчают корковое вещество почки крысы и гомогенизируют четырьмя
ходами гомогенизатора Поттера - Элвехейма, пестик которого вращается со
скоростью 1000 об/мин (разд. 2.2.1), в 0,3 М сахарозе, 1 мМ ЭДТА; раствор
доведен до pH 7.4 трпсом (буфер А). На 1 г ткани берется 10 мл раствора.
2. Центрифугируют при 270 g 5 мин, собирают супернатант и центрифугируют
его при 3000g 10 мин (ротор Sorvall SS.34). Удаляют супернатант и рыхлую
верхнюю часть осадка и ресуспендируют осадок в большом объеме (Х20)
буфера А. Центрифугируют при 500 g по 5 мин дважды, чтобы осадить
эритроциты, а затем центрифугируют супернатант при 3000 g 10 мин, чтобы
получить грубую лизосомную фракцию.
3. Ресуспендируют осадок в минимальном объеме буфера А (300 мкл/г ткани).
Готовят градиент перколла. Для этого берут перколл, 2 М сахарозу
26
Глава 1
Продолжение
п 0,1 М 3-(М-морфолнн)пропансульфэповую кислоту, pH 7,4, в отношении 75 :
15 : 10 (по объему), всего 14 мл, ц центрифугируют при 48ОООg 50 мшт (в
стеклянных пробирках, ротор SS.34).
4. Наслаивают ресуспендированную грубую фракцию лизосом на градиент
перколла и центрифугируют при 48 ООО g 30 мнн. Результат разделения
показан на рис. 1.3. Собирают фракцию 4, разводят буфером А п
центрифугируют при 3000 g 10 мин, чтобы получить лизоеомы в супернатанте
без перколла.
') По данным работы 171].
2) По данным работ 149, 50],
3) См. работы 172. 73].
*) По данным работы 151].
Непрерывные нзоосмотические градиенты готовят с помощью двухкамерного
смесителя. После разделения фракции собирают, опустив тоненькую трубочку
на дно центрифужной пробирки и затем либо отсасывая их, либо вытесняя
вверх подслоением тяжелого сахарозного раствора или инертного невязкого
раствора максиденза с плотностью 1,9 г/мл, не смешивающегося с водной
средой (продукция фирмы Nycomed). Исходные 40%-ные растворы метризамида и
найкоденза готовят в 0,25 М сахарозе и при необходимости разбавляют этим
же раствором сахарозы. Для получения плотности ниже 1,10 г/мл раствор
сахарозы можно заменить водой. Рассмотрим несколько примеров
фракционирования в градиентах найкоденза.
1. Субфракционирование эндоцитозных везикул из печени крысы. Наслаивают
"легкую" микросомную фракцию (полученную так, как указано в табл. 1.12)
на непрерывный градиент найкоденза, приготовленный с помощью смесителя из
б мл 27,6%-ного и 6 мл 13,8%-ного (в/о) растворов найкоденза в 0,25 М
сахарозе и воде соответственно. Центрифугируют при 98 000g в течение 2 ч
в роторе с подвесными стаканами (Beckman SW 28), чтобы разделить две
содержащие лиганды эндосомные фракции (разд. 5.7) с плотностями 1,090 и
1,115 г/мл [77, 78].
2. Выделение лизосом или пероксисом. Создают градиент 19-30% (плотность
1,105-1,16 г/мл). Наслаивают митохондриальную фракцию из печени крысы
[75] (см. разд. 5.3 и 5.4, где методика описана полнее) и собирают
лизоеомы (плотность 1,110-1,135 г/мл) и пероксисомы (плотность 1,21-1,26
г/мл) после центрифугирования при 97 000 g в течение 2 ч.
