Биологические мембраны - Финдлея Дж.Б.
ISBN 5-03-001317-2
Скачать (прямая ссылка):
Методика определения
1. Пипеткой вносят аликвоты липидных экстрактов в хлороформе в
пробирки с пробками. Испаряют растворитель в потоке азота.
176
Глава 4
2. Добавляют 6 мл ледяной уксусной кислоты, перемешивают и добавляют 4,0
мл реагента б). Перемешивают и через 10 мин измеряют оптическую плотность
при 550 нм (пурпурная окраска) относительно контрольного образца.
3. Строят калибровочную кривую, заменив при добавлении ледяной уксусной
кислоты часть ее объема стандартным раствором холестерола (0-1,5 мкмоля).
Осаждение свободного холестерола
1. Вносят пипеткой аликвоты липидного экстракта в конические центрифужные
пробирки объемом 15 мл. Испаряют растворитель в потоке азота и добавляют
1,0 мл смеси ацетон/95 %-ный этанол (1:1, о/о).
2. Добавляют 1,0 мл реагента в). Оставляют пробирки на 10 мин.
3. Осаждают образовавшийся осадок центрифугированием при 300 об/мин в
течение 5 мин, отбрасывают надосадочную жидкость и дают стечь остаткам
жидкости из пробирок в течение 5 мин.
4. Ресуспендируют осадок в 4,0 мл ацетона с помощью вортекса или
аналогичного встряхивателя и повторно центрифугируют. Подсушивают в
слабом потоке азота.
5. Растворяют осадок в 6 мл ледяной уксусной кислоты и выполняют
остальные операции, как при определении общего холестерола.
Калибровочная кривая линейна в диапазоне 0-1,5 мкмолей холестерола;
чувствительность метода 0,05 мкмоля холестерола.
Анализ на холестерол широко применяется в клинике, и в продаже имеются
аналитические наборы для его определения ферментативным методом с помощью
холестеролоксидазы. Этот метод более чувствителен, чем описанный выше
колориметрический анализ, однако соответствующие наборы предназначены для
исследования образцов сыворотки и мало пригодны для анализа липидов,
выделенных из мембран. Аналитические .наборы для определения холестерола
поставляются такими фирмами, как Boehringer, Sigma и BDH.
4.5. Определение свободных жирных кислот
Колориметрическое определение свободных жирных кислот основано на
получении соответствующих солей меди и последующей их реакции с
диэтилдитиокарбаматом [20].
Реагенты
а. Растворяют 6,45 г Си(N03)2-3H20 в 100 мл воды. Смешивают 10 объемов
полученного раствора с 1 объемом 1 М уксусной кислоты и 9 объемами 1 М
триэтаноламина в воде. Смесь следует готовить непосредственно перед
использованием
Разделение и анализ липидиых компонентов мембран
177
из указанных трех растворов, которые можно хранить длительное время.
б. Растворяют 0,1 г диэтилдитиокарбамата натрия в 100 мл бутанола.
Раствор можно хранить при 4°С не более недели.
Методика определения
1. Пипеткой вносят раствор жирной кислоты в хлороформе в пробирки с
пробками емкостью 15 мл.
2. Добавляют 2,5 мл реагента а) и перемешивают встряхиванием в закрытой
пробирке в течение 2 мин.
3. Разделяют две фазы центрифугированием. Удаляют верхний водный слой с
помощью шприца или пастеровской пипетки и отбирают из нижней фазы 3 мл,
стараясь не загрязнить аликвоту материалом верхней фазы.
4. Добавляют 0,5 мл реагента б), перемешивают и измеряют оптическую
плотность при 440 нм (желтая окраска) относительно контрольного образца.
Калибровочная кривая линейна в диапазоне 0-100 мкг жирной кислоты;
чувствительность метода 10 мкг жирной кислоты.
5. Исследование трансмембранного распределения липидов
Изучению трансмембранного распределения липидов посвящено несколько
обзоров [21-23]. В них суммирована информация об исследованных мембранных
препаратах н использованных методах, но не рассмотрены практические
вопросы методики экспериментов. В этом разделе мы детально опишем методы
определения трансмембранного распределения липидов на примере микросом
печени крысы. Однако эти методы носят универсальный характер и в принципе
могут использоваться также для других мембран при условии, что выполнены
все необходимые контрольные эксперименты.
При исследовании трансмембранного распределения фосфолипидов в качестве
инструментов используют фосфолипазы, химические модифицирующие реагенты и
фосфолипидобмени-вающие белки. Целесообразность их применения в качестве
молекулярных зондов зависит от объекта исследования и условий
эксперимента. Однако во всех случаях должны быть удовлетворены следующие
общие требования.
1. Исследуемые мембраны должны образовывать замкнутые непроницаемые
везикулы, произошедшие из внутриклеточных мембранных органелл одного типа
и имеющие одинаковую морфологическую ориентацию.
2. Применяемые зонды не должны проникать через мембрану и нарушать ее
целостность.
12-1488
178
Глава 4
3. В процессе эксперимента фосфолипиды в мембранах не должны
перегруппировываться и подвергаться какнм-либо структурным нарушениям.
5.1. Мембранные препараты
Мембраны эндоплазматического ретикулума гепатоцитов в форме везикул
(микросом) можно выделить из печени крысы дифференциальным
центрифугированием (гл. 1). По данным электронной микроскопии и
цитохимического анализа все микросомные везикулы имеют одинаковую
