Биологические мембраны - Финдлея Дж.Б.
ISBN 5-03-001317-2
Скачать (прямая ссылка):
интактных пластид.
Таким образом, фракционирование растительных клеток осложняется наличием
трех дополнительных факторов: присутствием клеточной стенки, вакуолей и
пластид. У растений ва-куолярная система развита гораздо сильнее, чем у
животных; в то же время лизоеомы как таковые в растительных тканях вообще
не обнаружены. Митохондрии, ядра, эндоплазматический ретнкулум, аппарат
Гольджи, пероксисомы, липидные капли, окаймленные везикулы и секреторные
гранулы - это органеллы, присутствующие как в животных, так и в
растительных клетках (см. гл. 1). В связи с большей сложностью
растительных объектов при всех процедурах выделения мембран из них
необходимо учитывать наличие не только митохондрий, эндоплазматического
ретикулума, аппарата Гольджи и плазматических мембран, но и тонопласта и
пластид. Ранее с таким учетом были проведены только отдельные
исследования, поэтому во мно-
64
Глава 2
гих экспериментах использовались мембранные препараты без адекватной
оценки их состава. Ясно, что подобная практика не может считаться
допустимой.
2. Приготовление гомогената
Прежде чем приступать к гомогенизации, необходимо:
1) приготовить среду, в которую будет высвобождаться клеточное
содержимое;
2) выбрать способ разрушения клеток;
3) выбрать первоначальные этапы очистки, необходимые для удаления
клеточных стенок, их фрагментов и крупных обломков клеток.
Полученный в результате так называемый суммарный бес-клеточный гомогенат
используется для последующей очистки. Кроме того, он подвергается
биохимическим исследованиям для составления таблиц распределения
активностей и расчета их выхода.
2.1. Среда для гомогенизации
Состав сред, использующихся при выделении и очистке индивидуальных
клеточных компонентов, мы приведем в следующих разделах. Обычно в эти
среды входят осмотически активное вещество, буфер и агенты,
предотвращающие деградацию мембран, такие, как декстран, альбумин,
ингибиторы протеаз (классификацию см. в гл. 1) и протекторы
сульфгидрильных групп. Для получения шероховатого эндоплазматического
ретикулума необходимо присутствие в среде таких ионов, как Mg2+. В
некоторых случаях желательно наличие в среде одновалентных ионов натрия
или калия либо и того и другого.
2.2. Методы гомогенизации
Один из возможных методов состоит в измельчении ткани с помощью
механического резака, снабженного бритвенным лезвием [3]. Этот способ,
вполне пригодный для аналитических целен, неприемлем для решения
препаративных задач из-за слишком больших затрат времени. Можно
использовать гомогенизатор Polytron (политрон) [4], действующий по
принципу вращающихся ножниц. Скорость вращения гораздо ниже той, при
которой возникают звуковые или кавитационные эффекты. Политрон прост в
обращении, вся процедура занимает немного времени и дает воспроизводимые
результаты. Выход мембран при этом больше, чем при использовании резака с
бритвенным лезвием. К недостаткам метода относится образование большого
Мембранные фракции растительных клеток
65
числа разных обломков, получающихся при интенсивном перемешивании
гомогената уже после разрушения клеток. Гомогенизатор с бритвенным
лезвием этого недостатка лишен. Для гомогенизации 10-20 г исходного
материала его рекомендуется включать на 5 мин при частоте движений 50-
60/с. С помощью политрона ткань обычно гомогенизируют в течение 2 мин при
3000-4000 об/мин. Можно использовать и ступку.
Отношение ткань/среда при гомогенизации должно быть достаточно высоким.
Если применяется политрон, то вся среда для гомогенизации добавляется с
самого начала. В случае гомогенизатора с бритвенным лезвием среда
вносится постепенно. На одну часть ткани желательно брать одну часть
среды (в/о); в любом случае это отношение не должно быть ниже 1 :2, иначе
ухудшится сохранность органелл.
Температуру во время гомогенизации обычно поддерживают около 4°С. Если
буфер охлажден, то нет необходимости работать в холодной комнате. Как
правило, температура гомогената не должна превышать 25 °С.
2.3. Удаление клеточных стенок и крупных обломков
Чтобы освободиться от клеточных стенок, их фрагментов и крупных обломков
клеток, применяют разные способы фильтрования; это предпочтительнее
центрифугирования, поскольку некоторые фрагменты имеют тенденцию к
флотации, а крупные компоненты (например, ядра) при центрифугировании
теряются. Через один слой Miracloth (Chickopee Mills, New-York), пористой
целлюлозной ткани, почти количественно проходят ядра, но задерживаются
фрагменты клеточных стенок. Для фильтрования можно использовать и мелкую
нейлоновую сетку. Перед фильтрованием гомогенат необходимо перемешать и
размять плоским шпателем о стенки сосуда, чтобы выдавить содержимое
разрушенных клеток. Как целлюлозный, так и/или нейлоновый фильтр следует
отжать после фильтрования, чтобы собрать как можно больше жидкой фракции
и получить больше мембранного препарата.
2.4. Стабилизация гомогената
Чтобы устранить эффекты, связанные с высвобождением содержимого вакуолей,
