Биологические мембраны - Финдлея Дж.Б.
ISBN 5-03-001317-2
Скачать (прямая ссылка):
- ЗиекпрсрорРЗ
В свободном потоке
Рис. 1.8. Выделение эндосом н обедненных эндосомами фракций аппарата
Гольджи из печени. Объяснения к схеме см. в табл. 1.12.
предотвратить разрушение везикул из мозга быка [42] и печени крысы [149].
Для выделения окаймленных везикул необходимо большое количество ткани;
например, для печени выход составляет 1-2 мг белка на 40 г печени [150].
Окончательная очистка проводится так, как описано в табл. 1.11, или с
применением проникающей (адсорбционной) хроматографии на колонке с
сефакрилом, что позволяет отделить окаймленные везикулы от гладких [149]
(разд. 3.3); можно провести электрофорез в агарозном геле (разд. 3.4)
[113, 115] или иммуноадсорбцию (гл. 3).
Органеллы и мембраны животной клетки
49
Таблица 1.11. Выделение окаймленных везикул из плаценты человека1'
1. Берут зрелую плаценту и измельчают 250 г ворсинок без мембран,
пуповины и кровеносных сосудов.
2. Гомогенизируют ткань в равном объеме буфера 1 [1 мМ ЭГ'ГА, 5 мМ MgCh,
NaN3 (0.2 мг/мл), 0,1 М МЭС, pH 7,4] в гомогенизаторе для измельчения
тканей в три приема по 10 с при полной скорости.
3. Центрифугируют гомогенат при 15 ООО g 40 мин. Собирают супернатант и
центрифугируют его при 85 000 g 1 ч.
4. Ресуспендируют осадок (в гомогенизаторе Даунса) в 40 мл буфера 1 и
наслаивают его на ступенчатый градиент сахарозы, состоящий нз следующих
растворов сахарозы в буфере 1: 60% (в/о), 4,5 мл; 50%, 4,5 мл; 40% 9 мл;
10%, 9 мл; 5%, 4,5 мл. Центрифугируют в роторе Beckman SW 28 (илн
аналогичном) при I00 000g 70 мин.
5. Собирают материал, находящийся на границе раздела растворов сахарозы с
концентрацией 10 н 40%, в также материал, находящийся в самих этих
растворах. Разводят в три раза буфером 1 и центрифугируют при 100 000 g 1
ч.
6. Ресуспендируют осадок в 9 мл буфера 1, оценивают содержание белка и
добавляют агглютинин из зародышей пшеницы (1 мг на 10 мг мембранного
белка). Оставляют на 2 ч при комнатной температуре илн на ночь при 4'С н
осаждают агглютинированный материал центрифугированием при 20 000 g 15
мин. Собирают супернатант и центрифугируют при 165 000 g 1 ч.
7. Ресуспендируют последний осадок в 1,5 мл буфера 1. Выход составляет
около 3 мг бетка.
') Из работы (14/1.
5.7. Эндосомы (эндоцитозные везикулы)
Эндосомы (рецептосомы, пиносомы)-это мембранные везикулы, происходящие из
эндоцитозных мембранных сетей. Последние представляют собой везикулярно-
тубулярную систему, простирающуюся от плазматической мембраны внутрь
клетки. Эта система участвует в переносе и сортировке комплексов рецептор
- лиганд после эндоцнтоза [8].
В разд. 3.1.1 описан метод изменения плотности для получения единой
популяции эндосом печени. Другой метод, в котором не применяются
связанные с пероксидазой лиганды для модификации плотности и в котором
получаются три субфракции эндосом печени, представлен в табл. 1.12 и на
рис. 1.8. В разд. 3.1.1 подробно изложено использование градиентов
найкоденза для отделения содержащих лиганды безрецепторных эндосом от
везикул с рецепторами.
Биохимические свойства эндосомных мембран известны далеко не полностью.
Перфузия печени различными меченными иодом лигандами и прослеживание их
субклеточной локализации в эндосомах (асиалогликопротеины, полипептидные
гормоны и т. д.) показывают, что эти лиганды в эндосомах не разрушаются;
это свидетельствует об отсутствии высокоактивных
4-1488
БО
Глава 1
Таблица 1.12. Выделение эндосом печени и мембран аппарата Гольджи,
обедненных эндосомами (рис. 1.8)
1. Препарируют две печени крысы (~15-20 г сырого веса), измельчают
ножницами и гомогенизируют в гомогенизаторе Даунса (объем 35 мл, зазор
0,12 мм; Blaessig, Rochester, NY, USA) 10 ходами пестика в 0,2 М сахарозе
(три объема на 1 г сырого веса).
2. Фильтруют гомогенат через нейлоновую марлю 50-100 меш (Swiss Silk
Bolting Cloth Manufacturing Co. Ltd, Zurich, Switzerland) и проводят
повторную гомогенизацию шестью ходами плотно притертого пестика (зазор
0.07 мм).
3. Центрифугируют гомогенат в поликарбонатных пробирках в угловом роторе
8x50 мл (Sorvall SS-34 или аналогичном) при 1000 g 10 мин; дважды
промывают осадок, ресуспеидируя его (1,5 объема на 1 г сырого веса
печени) и центрифугируя в 0,25 М сахарозе; объединяют супернатанты (их
объем составляет -100 мл).
4. Центрифугируют объединенные супернатанты при 33 000 g 8 мин в роторе
типа Beckman. Если центрифуга снабжена программным устройством,
устанавливают ее на 2,61-109 рад2/с. Собирают супернатант, стараясь не
захватить рыхлый материал, остающийся поверх многослойного осадка.
5. Наслаивают супернатант на шесть градиентов сахарозы в пробирках по 38
мл (ротор Beckman SW28). Градиенты формируют следующим образом: берут 1
мл 70%-иой (в/о) сахарозы и 5 мл 43%-иой сахарозы, затем смешиванием 7,5
мл 40- и 10%-ной сахарозы создают непрерывный градиент.
6. Центрифугируют при 100 000 g 4 ч. Собирают фракции (40 фракций по 0,7
мл), проткнув дно пробирки иглой шприца, подсоединенного к
