Биологические мембраны - Финдлея Дж.Б.
ISBN 5-03-001317-2
Скачать (прямая ссылка):
> 2-пропанол>бутанол. Особенно широко используется аието-ннтрнл - он
обладает низкой вязкостью н хорошей растворяющей способностью; кроме
того, его можно приобрести за умеренную цену в очищенном виде (без
примесей, поглощающих в УФ-области). Как пример типичного градиента можно
указать переход от 0,1%-ной ТФУ, содержащей 10% ацетонитрила, до 0,1%-ной
ТФУ, содержащей 70% ацетонитрила. Для улучшения растворимости пептидов
предложено вводить в небольших количествах такие добавки, как
монометоксиэтиленгликоль. Если
264
Глава 6
использовать подобные подвижные фазы, то пептиды, нанесенные в растворах
сильных кислот и в начале хроматографии практически нерастворимые, при
нарастании градиента органического растворителя могут перейти в раствор и
элюироваться при его достаточно высоких концентрациях.
К сожалению, многие из крупных и гидрофобных пептидов, образующихся при
расщеплении интегральных мембранных белков, не элюируются вообще или
вымываются с очень низким выходом с помощью С 18-носителей и
растворителей, указанных выше. В этих случаях нередко приходится
прибегать к жестким условиям. Так, Корана и др. [42] использовали на С18-
сорбенте градиентный переход от 5%-ного водного раствора муравьиной
кислоты до 5%-ного раствора этой же кислоты в этаноле. Нам удалось
достичь определенных успехов при переходе от 50%-ной муравьиной кислоты в
воде до 50%-ной муравьиной кислоты в изопропаноле или этаноле (Medina,
Findlay, неопубликованные данные). В обоих случаях целесообразно
использовать аппаратуру и колонки для проведения СЖХБ (фирма Pharmacia),
поскольку они более устойчивы в таких жестких условиях. Есть и другие
системы растворителей, также довольно успешно использовавшиеся; это 0,24
М ацетат калия (pH 6,5) в смеси хлороформ/метанол (1:2, о/о), содержащей
8% воды и 1% бензола [43], смеси хлороформ/метанол с разным соотношением
компонентов [44], градиент 10-60% 12 мМ НС1, этанол/н-бутанол (4:1, о/о)
в 12 мМ НС1 [45] с добавлением ДМСО до 1 % в конце градиента.
Исходя из общих эмпирических соображений, можно рекомендовать сначала
проводить фракционирование белков и пептидов на сефадексе LH-60 и LH-20,
а затем объединенные фракции, содержащие пептиды близкой молекулярной
массы, подвергать хроматографии с обращенной фазой, как это описано выше.
Высушивание пептидов и белков следует проводить с осторожностью на
роторном испарителе до влажного состояния образца с последующим удалением
остатков растворителя лио-филизацией. Чтобы облегчить повторное
растворение и/или дезагрегацию, можно внести в сухой образец небольшой
объем (100 мкл) безводную ТФУ перед добавлением основного растворителя.
3.4. Аффинная хроматография
Этот метод позволяет проводить очистку, основываясь на биологическом
сродстве или активности, которыми обладают лишь определенные компоненты в
разделяемой смеси белков и пептидов. Мембраносвязанные ферменты,
например, могут адсорбироваться на нерастворимых носителях, с которыми
ковалентно связаны аналоги субстрата, простетические группы или
Выделение и модификация мембранных белков
265
специфические эффекторы. Рецепторы связываются с иммобилизованными
фармакологическими препаратами или гормонами. Ясно, что для успешной
реализации этого подхода необходимо солюбилизировать мембраны в таких
условиях, чтобы исследуемый белок сохранил свою биологическую активность.
Адсорбировавшийся белок обычно снимают с носителя с помощью агента,
который эффективно конкурирует с иммобилизованным лигандом за центр
связывания. Этим методом можно как концентрировать, так и очищать белок.
Полное описание теории и практики аффинной хроматографии дано в одной из
книг этой серии [46J. Здесь мы уделим внимание главным образом ее
применению для фракционирования мембранных белков и пептидов.
3.4.1. Носители
В качестве неподвижного носителя можно использовать целый ряд материалов
- декстраны, целлюлозу, силикагели, стекло и синтетические смолы, однако
наиболее эффективными оказались сефароза, агароза, полиакриламид и, по
последним данным, полистирол. При выборе геля с необходимой пористостью
следует принимать во внимание прежде всего размер образующегося комплекса
белок - лиганд. При этом нужно иметь в виду, что рецепторный белок может
состоять из нескольких субъединиц и что связывание детергента приводит к
значительному увеличению размеров солюбилизированного белка. Носители
активируют так, чтобы они приобрели способность ковалентно связывать
специфический лиганд. Часто удобнее начать с имеющихся в продаже
разнообразных активированных сорбентов (предлагаемых, например, фирмами
Beckman, Bio-Rad, Calbio-chem, Pharmacia, Pierce). Они имеют различные
реакционноспособные функциональные группы, связанные с гелем либо
непосредственно, либо через удлинительный мостик (спейсер) (см. табл.
6.1). Эти мостики повышают доступность иммобилизованного лиганда для
белка и уменьшают стерические ограничения, что особенно важно для
