Вирусология: В 3-х т. Том 1 - Филдс Б.Н.
ISBN 5-03-000283-9
Скачать (прямая ссылка):
Транскрипционное картирование используют для определения порядка генов у тех РНК-содержащих вирусов, которые не рекомбинируют и поэтому не могут быть объектом стандартного генетического картирования. Методы, применяемые для этих вирусов, зависят от наличия единственного промотора, с которого начинается транскрипция полицистронной РНК, впоследствии разрезаемой на индивидуальные мРНК. Матрица транскрипции служит мишенью для внесения ультрафиолетовых повреждений, которые блокируют транскрипцию участка, расположенного за сайтом повреждения. Облученный УФ-светом вирус используют для заражения или транскрипции в бесклеточной системе, и затем определяют количество каждого транскрипта. Гены, расположенные дальше от промотора, представляют большую мишень, чем гены, расположенные ближе к промотору; благодаря этому остаточная транскрипционная активность каждого гена становится мерой расстояния от промотора. Картирование по транскрипционному размеру мишени использовали для определения порядка генов у вируса везикулярного стоматита [4] и вируса ньюкаслской болезни [17].
Трансляционные карты
Одна из первых карт генома вирусов животных была полу* чена для вируса полиомиелита с использованием метода так называемого «пактамицвнового картирования» [142, 144]. Картирование этим методом основано на том, что а) пактамицин подавляет инициацию белкового синтеза, но разрешает продолжаться синтезу уже инициированной белковой цепи и б) трансляция генома вируса полиомиелита начинается с одной точки и приводит к образованию гигантского полипептид а-предшест-вевника. Если к зараженным клеткам, активно синтезирующим вирусный белок, добавить пактамицин и изотопную метку, то метка будет включаться только в те белки, синтез которых начался еще до добавления ингибитора. Поскольку синтез белка осуществляется на РНК в направлении 5' * 3', те белки, кото-
рые закодированы ближе к З'-концу, будут содержать много метки, а те, которые закодированы ближе >к 5'-концу, будут содержать очень мало метки, либо будут совсем иемеченными. Таким образом, последовательности, кодирующие различные белки вируса полиомиелита, были упорядочены по отношению к 5'-концу вирусной хромосомы. Метод пактамицвнового картирования применяли и к другим энтеровирусам.
Трансляционная карта получена еще для одного нерекамби-вирующего вируса — тогавируса Синдбис {45]. Это сделали, определяя чувствительность к ультрафиолету процесса трансляции двух полицистронных мРНК, синтезируемых вирусом. Размер мишени использовали для картирования белков по отношению к единственной точке инициации трансляции на каждой мРНК. Поскольку порядок двух/полицистронных мРНК в геноме известен, был установлен также и порядок белков во всем геноме.
Наконец, трансляционные карты получены для вирусов с сегментированным двухцепочечным РНК-геномом, сегменты которого моноцистронны. Разработан метод выделения индивидуальных сегментов, их денатурации и трансляции in vitro [91], [который позволил определить белки, 'кодируемые отдельными геномными сегментами.
Генная инженерия и генетика вирусов
Разработка новых приемов для манипуляции с нуклеиновыми кислотами, обычно называемых «генной инженерией», открыла новые возможности для генетических исследований вирусов животных. Эти приемы привели ж выяснению наиболее фундаментальных характеристик структуры генома ряда вирусов и определению последовательности нуклеотидов. У некоторых вирусов была расшифрована только часть последовательности.
В свою очередь расшифровка последовательностей позволила обнаружить регуляторные сигналы для различных молекулярных событий жизненного цикла вируса и предсказать аминокислотную последовательность продуктов многих генов. Молекулярное клонирование ДНК-иопий РНК-геномных вирусов позволило применять для изучения этих вирусов методы, разработанные для ДНК. Применение методов генной инженерии обещает быстрый прогресс в понимании многих генетических явлений на молекулярном уровне. Приводимые ниже примеры иллюстрируют эффективность этих методов.
Изучение экспрессии вирусных генов
Регуляция экспрессии вирусных генов уже давно была фундаментальным вопросом, вызывавшим большой интерес. Традиционный генетический подход встречает трудности при изучении регуляции в связи с редкостью регуляторных мутаций; возможно, это обусловлено тем, что структурные гены, находящиеся под контролем, имеют гораздо больший размер, чем последовательности, которые их регулируют. Кроме того, регуляторные мутации, используемые в стандартном генетическом анализе, обычно имеют фенотип «все или ничего», что не позволяет получить существенную информацию о модуляции экспрессии генов. Молекулярное клонирование вирусных структурных генов и их регуляторных элементов привело к идентификации элементов, участвующих в разнообразных регуляторных механизмах. Благодаря определению структуры клонированных генов, а также использованию векторов на основе вирусов животных удалось выявить структуру промоторов транскрипции (ТАТА-последова-тельность, или последовательность Хогаесса) и участки, модулирующие транскрипцию этих промоторов (энхансеры) [119]. Идентификация регуляторных участков сделала возможной манипуляцию с ними с целью понять механизм их действия. В дополнение к этому можно воздействовать на вирусные гены в составе экспрессирующих векторов и затем изучать влияние этих воздействий на функцию генного продукта [143].
