Вирусология: В 3-х т. Том 1 - Филдс Б.Н.
ISBN 5-03-000283-9
Скачать (прямая ссылка):
но локализована по отношению к остальным мутациям на хромосоме. Максимальная теоретическая частота рекомбинации, равная 50%, следует из частоты генетических обменов, которые могут происходить между отдаленным'И маркерами. Рекомбинантным сочетанием этих маркеров будут обладать только дочерние хромосомы с нечетным числом рекомбинационных событий между маркерами, и, если рекомбинационных обменов будет много, лишь 50% будут содержать требующееся нечетное число обменов.
У вирусов с сегментированным геномом наблюдается иной тип рекомбинации. При парных скрещиваниях мутантов частота рекомбинации либо очень высока, либо рекомбинация не обнаруживается вовсе. Такая -рекомбинация по типу «все или ничего» интерпретируется следующим образом: в случае отсутствия рекомбинации считают, что обе мутации расположены на одном и том же сегменте генома, так что обмен сегментами не приводит к появлению сочетания маркеров, отличного от родительского (сегменты, не имеющие мутаций, могут обмениваться с образованием неродительских комбинаций, однако последние нельзя выявить). В парах мутантов, для которых наблюдается высокая частота рекомбинаций, считают, что мутации располагаются в различных сегментах генома, и таким образом обмен сегментами при скрещивании может дать неродительское сочетание маркеров (сегменты, которые не несут мутаций, естественно, также могут обмениваться). Никакого градиента частот рекомбинаций при этом не обнаруживается; это указывает на то, что внутримолекулярная рекомбинация по механизму разрыв — воссоединение не происходит с заметной частотой. В системах, в которых происходит обмен маркеров, ожидаемая частота рекомбинации составляет 50%. Однако такая частота редко наблюдается, поскольку на реассортацию сегментов генома могут влиять многочисленные пока плохо изученные факторы.
Рекомбинационный анализ легче всего проводить с мутантами условно-летального типа. Для проведения тестов на рекомбинацию клетки подвергают смешанному заражению мутантами двух типов, а также заражению мутантами по отдельности. Зараженные клетки инкубируют при пермиссивных условиях в течение времени, достаточного для завершения цикла репликации. Урожай вируса в смешанно и раздельно зараженных клетках определяют, титруя вирус в непермиссивных условиях, для того чтобы определить количество рекомбинантов, имеющих дикий фенотип, или урожай ревертантов в случае раздельного заражения. При смешанном заражении определяют также полный урожай вируса в пермиссивных условиях. Частоту рекомбинации вычисляют следующим образом: урожай рекомбинантов дикого типа при смешанном заражении (измеренный при непермиссив-
ных условиях) корректируют на вклад реверсии, вычитая из этого урожая сумму урожаев раздельно зараженных клеток (измеренных при непермиосивных условиях). Затем это число рекомбинантов дикого типа делят на суммарный урожай при смешанном заражении (измеренный при пермиссивных условиях), в результате чего получают долю урожая, которую составляют рекомбинанты дикого типа. Поскольку рекомбинация в популяции реципрокна, долю рекомбинантов дикого типа умножают на 2, для того чтобы учесть двойные мутанты, которые не могут быть обнаружены таким образом. Наконец, долю рекомбинантов приводят к -процентам, умножая «а 100. Для некоторых вирусов, у которых реципрокность рекомбинации не доказана, поправки на двойную рекомбинацию не делают, и частоты рекомбинации выражают как процент рекомбинантов дикого типа. Другим способом оценки рекомбинации служит определение индекса рекомбинации, который соответствует повышению урожая рекомбинантов дикого типа при смешанной инфекции в непермиосивных условиях по сравнению с урожаями при раздельном заражении. Хотя данные о рекомбинации в форме индексов рекомбинации нельзя использовать для точного расчета карт сцепления, они полезны в случае вирусов с сегментированным геномом, у которых не наблюдается сцепления признаков и рекомбинационные тесты 'просто либо положительны, либо отрицательны. Индекс рекомбинации используют потому, что его расчет очень прост и требует титрования урожая только при не-пермиссивных условиях.
Рекомбинационный анализ проводили различными способами с использованием разнообразных маркеров. Ниже мы обсудим некоторые применявшиеся типы рекомбинационного анализа и ту информацию, которая может быть извлечена из каждого из них.
Двухфакторные скрещивания
Двухфакторные скрещивания проводили практически со всеми коллекциями мутантов. На основании знания частот рекомбинации, полученных при попарных скрещиваниях вирусов, рекомбинирующих по механизму разрыв — воссоединение, можно расположить все мутации на линейной карте. Мутанты каждой комплементационной группы обычно располагаются в небольшой области этой карты, что указывает на повреждения в одном гене. Максимальное расстояние между мутациями в одной группе комплементации позволяет получить минимальную оценку размера гена. В табл. 7.2 содержатся типичные результаты, полученные при двухфакторных скрещиваниях; в данном случае использовали /s-мутанты HSV-1 [128], для которых градиент ча-
