Вирусология: В 3-х т. Том 1 - Филдс Б.Н.
ISBN 5-03-000283-9
Скачать (прямая ссылка):
русного генома в эпидермальных клетках — неизвестно. Никаких природных систем, в которых происходила бы экспрессия генов HPV на уровне, достаточном для биохимического анализа, не найдено. Пытаясь получить модельную систему для изучения репликации HPV, культивируемые эпидермальные клетки человека (кератиноциты) заражали нетипированным HPV, выделенным из подошвенных бородавок [164]. Было показано, что в этих клетках персистируют и реплицируются в виде эписом вирусные ДНК, однако никаких признаков синтеза белков вирусного капсида или вирусных частиц обнаружить не удалось^ 'По-видимому, степень дифференцировки кератиноцитов, культивируемых in vitro, недостаточна для поддержания продуктивной вирусной инфекции.
Чтобы создать экспериментальную систему, пригодную для идентификации вирусных мРНК и белков, в клетки мыши [20] и человека (Грин и др., в печати) вводили геномы HPV. При котрансфекции геном тимидинкиназы герпесвируса и каждым из пяти рекомбинантов, содержащих плазмиду pBR322 и один из следующих видов HPV—HPV-la, HPV-2, HPV-3, HPV-4 и 'HPV-9 [20],—мышиные клетки, лишенные тимидинкиназы (tk-), «биохимически трансформировались», приобретая фенотип tk+. Как показала блот-гибридизация ДНК, практически все клоны /к+-клеток содержали множественные вставки высокомолекулярной ДНК HPV. Большая часть последовательностей вирусных ,ДНК HPV в ^трансформированных клетках представлена не в виде эписомных ДНК геномного размера. Анализ нескольких клеточных линий, трансформированных HPV-la и HPV-3, показал, что в разных линиях клеток некоторые копии вирусного генома интегрируются сходным образом. Это приводит к отно-¦сительно высокому уровню экспрессии четырех или пяти видов цитоплазматической полиаденилированной РНК, содержащей вирусные последовательности. Каждый из этих видов РНК представляет собой гибридную молекулу из РНК HPV и РНК pBR322. Исходя из представлений о молекулярной организации генома HPV-la, основанных на результатах определения нуклеотидной последовательности ДНК [48], можно предположить, что гибридные РНК HPV-la/pBR322 — это молекулы разных ранних мРНК (например, Е1, Е4, Е6 и Е7), которые начинают считываться с одного общего раннего промотора HPV-la и кончают считываться на сигнале полиаденилирования pBR322 [20]; появление набора разных РНК обусловлено дифференцированным сплайсингом. Гибридные мРНК образуются вследствие того, что кодирующие области Е1, Е4, Е6 и Е7 в рекомбинантах pBR322/ /HPV-la отделены от сигнала полиаденилирования, расположенного вблизи 51-й единицы карты. Осуществляется ли трансля-щия гибридных молекул мРНК HPV-la/pBR322 с образованием
белков HPV — неизвестно. Отсутствуют также данные об экспрессии поздних генов BPV на уровне мРНК в таких линиях, ^трансформированных мышиных клеток.
Недавно путем трансфекции рекомбинантами HPV/pSV2neo« удалось ввести геном HPV в клеточные линии человека (Грип и др., в печати; pSV2neo—плазмида, кодирующая бактериальный' ген устойчивости к неомидину в форме, которая экспрессируется-в клетках млекопитающих [269]). Оказалось, что клоны клеток, отобранные по резистентности к G-18 — антибиотику, приводящему к гибели клеток, в которых не экспрессируется ген устойчивости к неомидину, — содержат рекомбинантные молекулы HPV/pSV2neo, реплицирующиеся в виде эписом и экспрессирующие различные виды вирусной РНК (Грин и др., в печати). Таким образом, эти биохимически трансформированные линии клеток могут оказаться полезными при идентификации ранних белков и предполагаемых трансформирующих белков HPV. Более того, рекомбинанты HPV/pSV2neo, очевидно, могут быть очень хорошими челночными векторами для введения чужеродных генов в клетки человека (Грин и др., в печати).
Нуклеотидная последовательность геномов папилломавирусов
Определение нуклеотидной последовательности ДНК BPV-1 (7945 нуклеотидов), HPV-la (7815 нуклеотидов) и HPV-6b (7902 нуклеотида) [2, 33, 48, 49, 257а] позволило выявить некоторые интересные особенности молекулярной организации генов папилломавирусов и предполагаемых вирус-специфических белков. По своей организации BPV-1, HPV-la и HPV-6b очень сходны [49, 257а]. На рис. 12.3 показаны открытые рамки считывания генома BPV-1 (области, потенциально кодирующие белки) ^ У BPV-1 в отличие от SV40 и Ру все открытые рамки считывания (с емкостью кодирования, превышающей 90 аминокислот) расположены на одной и той же цепи ДНК. Вирусные белки,, синтезируемые в соответствии с этими открытыми рамками считывания, можно подразделить на две функциональные группы. Ранние белки (El—Е7) локализованы в трансформирующей области, составляющей 69% длины генома, а поздние белки (L1 и L2) — в остальной части генома, составляющей 31% его-длины. Предполагаемая трансформирующая область HPV-1 не-картировалась с помощью прямого трансформационного анализа. Однако по результатам электронно-микроскопических исследований гетеродуплексов ДНК HPV-1/BPV-1 [45] и по распределению открытых рамок считывания на кодирующей цепи [49] в геноме HPV-1 была идентифицирована область, гомологичная трансформирующей области BPV-1. Отметим, что, как. следует из анализа нуклеотидной последовательности ДИК*.
