Вирусология: В 3-х т. Том 1 - Филдс Б.Н.
ISBN 5-03-000283-9
Скачать (прямая ссылка):
Во время трансляции мРНК VSV, как и РНК всех изученных
вирусов, связаны с цитоскелетом [16]. Это же относится и к мРНК для G-белка, которая присоединена к ШЭР. Поскольку после разрушения плазматической мембраны под действием детергента тритона Х-100 скелетные структуры сохраняются, можно сказать, что ШЭР ведет себя как часть цитоскелета и, вероятно, содержит белковую основу, которая и остается после удален ния липидов детергентом.
Наиболее убедительным свидетельством того, что для трансляции мРНК необходима ее связь с цитоскелетом, является синтез белка VSV [16]. Новосинтезированные РНК VSV проходят через полирибосомы в течение 30—40 мин, и все это время они остаются связанными с цитоскелетом. Затем РНК отсоединяется от скелета, и трансляция прекращается. То, что молекулы мРНК в свободном состоянии в цитоплазме не транслируются, является общим наблюдением, однако причинно-следственная связь между присоединением мРНК к цитоскелету и трансляцией еще не установлена.
Процесс сборки нуклеокапсидa VSV детально исследован в работе [17] с помощью химических сшивок. Он существенно обличается от сборки вирусов, не имеющих оболочки, таких как полиовирус. Во всяком случае, белок N от момента синтеза до-сборки остается связанным с элементами цитоскелета.
Связывание белков VSV с цитоструктурами удается обнаружить прежде всего с помощью метода импульсной метки с «чей-зом» (последующим разведением метки избытком немеченого-предшественника). Полученные результаты иллюстрируют все преимущества и недостатки использования вирусов в качестве модельных систем для изучения клеточного поведения. Соответствующим образом обработанные клетки, зараженные VSV, синтезируют лишь пять белков. Это позволяет детально проанализировать все этапы сборки вируса. Однако, как и в случае большинства вирусов, белки VSV продуцируются в избытке, и это-приводит к метаболическому тупику. Около половины синтезированных белков VSV находится в свободном состоянии в растворимой фазе цитоплазмы. С помощью сшивок показано, что они так никогда и не включаются в вирусные структуры.
В нуклеокапсиды входит та часть белков N, NS и L, которая связана с цитоскелетом. С помощью метода химических сшивок с последующим электрофорезом белков показано, что молекулы этих белков контактируют друг с другом. Для связанного с цитоструктурой белка N вначале обнаруживается диффузная картина взаимодействия с ближайшими соседями, являющимися, вероятно, структурными элементами клетки. В течение последующих 40 мин эта картина постепенно меняется и наконец вырисовывается характерная картина ковалентных сшивок, основной особенностью которой является наличие димеров N—N, обнару-
живаемых в нуклеокапсидах зрелых вирионов. Имеется также некоторое количество сшивок белка N с белками, отсутствующими в зрелом вирионе; очевидно, эти сшивки удерживают нуклео-капсид в цитоархитектуре. Интересно, что для встраивания белка N в вирус во время сборки требуется, чтобы белковый синтез продолжался. Аналогичное условие, по-видимому, выполняется во время сборки цитоскелета незараженной клетки [25].
SV40 — ядерный вирус, лишенный оболочки
Папилломавирусы (например, SV40) представляют собой довольно простую модельную систему, позволяющую изучать события, связанные с ядром, и ядерно-цитоплазмэтические взаимодействия, которые имеют место во время развития ядерных вирусов. Бен-Зе’ев и группа авторов из Вейцмановского института провели чрезвычайно интересное исследование связи метаболиз-
Г Метаболизм вирусов и клеточная архитектура 321
[
i
ма SV40 с цитоструктурами. Они обнаружили, что зрелые вирио-ны, содержащие ДНК в устойчивой к ДНКазе форме, остаются связанными с ядерным матриксом даже после удаления хроматина [3]. Действительно, микрофотографии стандартных залитых в эпон срезов показывают, что вирионы разбросаны по всему пространству ядра, из которого удален хроматин, хотя никаких поддерживающих структур не видно (рис. 11.6,А—Г). Более поздние исследования ядер с удаленным хроматином методом нанесения целого объекта без заливки показали, ,что вирионы присоединены к волокнам ядерного матрикса (рис. 11.6,Д). Очень полезным при исследовании этого и других ядерных вирусов мог бы стать метод тонких срезов без заливки в смолы, который позволяет увидеть достаточно четко ядерный матрикс (рис. 11.4).
рис. 11.6. Ядерный матрикс клеток, зараженных SV40. А—Г. Срезы, залитые эпоиом. Д. Микрофотография, полученная методом нанесения целого объекта без заливки смолой. Стрелки указывают на вирионы.
Бен-Зе’ев и др. [1] изучили также транскрипцию РНК SV40. Они показали, что транскрипты связываются с ядерным матриксом аналогично транскриптам незараженных клеток. Благодаря простоте вирусной транскрипции авторы смогли проанализировать метаболизм РНК весьма детально. Опыты in vivo и in vitro показывают, что поздние вирусные транскрипты образуются следующим образом. Сначала синтезируется «аттенуаторная» РНК, состоящая из 94 нуклеотидов, которая не связывается с ядерным матриксом и отщепляется от конечных транскриптов. РНК, синтезируемая после аттенуаторной, связывается с ядерным матриксом, где она, по-видимому, подвергается сплайсингу, в результате которого, образуется зрелая информационная РНК.
