Теория и практика иммуноферментного анализа - Егоров А.М.
ISBN 5-06-000644-1
Скачать (прямая ссылка):
§ 2. Ферменты, используемые в И ФА в качестве меток
Принципиальная возможность применения ферментов в качестве меток в ИФА обусловлена чрезвычайно высокой чувствительностью регистрации ферментов в растворе. Нижний предел регистрации ферментативной метки можно легко оценить, воспользовавшись выражением для максимальной скорости ферментативной реакции:
^-=Акат1Е10. (4.8)
За время At концентрация образующегося продукта будет равна: [Р]=Акат[Е]0Д*. (4.9)
Из уравнения (4.9) можно вычислить минимальную определяемую концентрацию фермента [Е]0. Если пр-инять &Кат~Ю3с-1 (хотя для многих ферментов она значительно больше), время реакции ~15 мин (~103 с) и считать, что обычными спектрофотометрическими (или флуорометрическйми) методами можно зарегистрировать образование продукта в концентрации* 10~6— 10~7 моль/л, то концентрация фермента [Е]0 составит:
1Е10—°~7- ^ 10-» моль/л. (4.10)
103.103
Таким образом, даже такой простой расчет показывает возможность детекции ферментов в очень малых количествах. Причем принципиально осуществимым является значительное уменьшение пределов обнаружения ферментов как за счет увеличения времени ферментативной реакции, так и увеличения чувствительности регистрации образующегося продукта. В этой связи к перспективным относятся люминесцентные методы детекции ферментативных реакций, а также методы, основанные на ферментативном усилении детекции продуктов первичной ферментативной реакции («каскады»).
• К выбору ферментных меток в ИФА предъявляется ряд общих требований. Основными являются следующие:
а) высокая специфичность и удельная каталитическая активность фермента, позволяющая обнаруживать ферментативную метку в низких концентрациях;
б) доступность ферментов; возможность получения достаточно чистых ферментных препаратов, сохраняющих высокую ферментативную активность после химической модификации при получении конъюгата, с антителами или антигенами;
в) стабильность в оптимальных условиях взаимодействия антигена с антителом;
г) простота и чувствительность метода определения концентрации фермента.
В следующей главе будет дана подробная классификация методов ИФА. Здесь же следует отметить, что все методы ИФА можно отнести к двум различным категориям — гетерогенным и гомогенным. В гетерогенных методах используются иммобилизованные (т. е. прочно связанные) на поверхности твердых носителей реагенты, а в гомогенных — все стадии ИФА проводят в водном растворе. В гетерогенных методах фермент играет роль обычного маркера антигенов или антител, в то время как в гомогенных методах фермент выступает как составная часть иммунохи-мической реагентной системы и должен обладать рядом весьма специфических свойств. В табл. 3.1 и 3.2 приведены основные свойства ферментов, используемых соответственно в гетерогенных и гомогенных методах, и способы регистрации их активности.
Наибольшее распространение в гетерогенном ИФА среди ферментов, удовлетворяющих перечисленным выше требованиям, получили пероксидаза хрена (КФ 1.11.1.7), щелочная фосфатаза (КФ 3.1.3.1) и p-D-галактозидаза (КФ 3.2.1.23). Все три фермента определяются на уровне пикомолярных концентраций. Наиболее доступной является пероксидаза. Она содержит легко окисляемые перйодатом углеводные остатки, через которые может осуществляться связывание фермента, с антителами или антигенами. В состав субстратной системы для измерения активности пероксидазы фотометрическим способом входят хромогены, дающие при окислении перекисью окрашенные соединения. При работе с большинством из них следует учитывать их канцерогенные и мутагенные свойства и соблюдать осторожность. Каталитическая активность глюкозооксидазы регистрируется с теми же хромогенами, что и пероксидазы, однако чувствительность ее определения по сравнению с пероксидазой несколько ниже. Основным достоинством фермента является полное отсутствие его в плазме крови, что дает возможность использования фермента в гомогенных методах ИФА.
Щелочная фосфатаза и ее конъюгаты имеют высокую стабильность и низкий предел обнаружения, однако недостатком является относительно высокая стоимость фермента. В последнее время разработаны сверхчувствительные ферментативные системы, позволяющие детектировать в растворе до нескольких тысяч молекул щелочной фосфатазы, основанные на использовании в качестве субстрата молекулы NADP. Образующийся в результате ферментативного гидролиза продукт NAD определяется в ферментативной системе регенерации кофактора. Такого рода подходы для определения щелочной фосфатазы являются весьма перспективными в плане создания на их основе сверхчувствительных методов ИФА. р-D-Галактозидаза является также широко используемым ферментом как в гомогенном, так и в гетерогенном ИФА.
Таблица 3.1. Ферменты, используемые в гетерогенном ИФА
85 Н К №
a1 oj « s
а а
н 0J
у-е*
О)
