Теория и практика иммуноферментного анализа - Егоров А.М.
ISBN 5-06-000644-1
Скачать (прямая ссылка):
Помимо технических существуют сложности и другого рода. Как уже отмечалось в предыдущем разделе, использование калибровочной зависимости правомерно лишь в тех случаях, когда соединения в стандарте и образце идентичны по способности к связыванию. Выделение же чистых антител иммуносорбцией, проводимое чаще всего при экстремальных значениях pH или ионной силы, может приводить к изменению их константы связывания с антигеном. Таким образом основное условие применения калибровочной зависимости может нарушаться.
Допустим, что эта проблема также решена и константа связывания антител в процессе выделения не изменилась. И в этом случае еще нет оснований считать результаты, полученные по калибровочному графику, истинными. Как известно, иммунный ответ организма на антиген индивидуален. Поэтому даже в том случае, если для приготовления стандарта использовался большой пул сывороток, велика вероятность, что среднеэффективная константа связывания антител в измеряемой сыворотке будет отлична от этой величины для стандарта, что опять будет приводить к неправильному определению концентрации. В связи с изложенным вопрос о точном определении концентрации антител является весьма проблематичным и на практике он ставится крайне редко.
Большее значение для практических целей имеют ответы на два вопроса: 1) как соотносится уровень антител в пробе со средним уровнем нормы и патологии; 2) какова динамика изменения уровня антител. Эта информация важна как для целей диагностики и контроля эффективности тералии заболевания, так и для характеристики иммунного ответа при получении антител.
Определение антител чаще всего проводят методом твердофазного ИФА, основанным на инкубации сыворотки с иммобилизованным антигеном, с последующим выявлением связавшихся специфических антител препаратом антивидовых антител, меченным ферментом.
Построение кривой титрования. Результаты эксперимента представляют в виде, графика, по ординате которого отложен регистрируемый в ИФА сигнал, а по абсциссе — разведение (или титр) исследуемой сыворотки (рис. 50). За титр исследуемой сыворотки принимается максимальное разведение, при котором данным методом анализа достоверно определяется наличие антител, т. е. в отличие от концентрации титр антител для данного образца не является постоянной величиной-, а зависит от чувствительности и точности метода анализа. (Например, титр сыворотки в ИФА больше, чем в реакции преципитации.) Так как регистрируемый в ИФА сигнал обусловлен как специфическими, так и неспецифическими взаимодействиями, обычно параллельно с исследуемой сывороткой титруют контрольную сыворотку той же видовой принадлежности, но заведомо не содержащую антител. Тогда за титр исследуемой сыворотки следует принимать максимальное разведение, при котором регистрируемый сигнал статистически достоверно отличается от сигнала в случае контрольной сыворотки.
При исследовании динамики изменения содержания антител в сыворотке методом титрования удобнее сравнивать не максимальные разведения, а разведения, соответствующие серединам кривых титрования на ординате. Сдвиг этой точки по абсциссе вправо свидетельствует об увеличении титра. При этом следует учитывать, что изменение титра сыворотки может быть обусловлено изменением как концен-
ТИТР
Рис. 50. График титрования сыворотки со специфическими антителами (1) и нормальной (2):
стрелкой показано максимальное разведение сыворотки (литр), при котором значения регистрируемого сигнала для двух сывороток различаются статистически достоверно; п — разведение сыворотки.
трации, так и аффинности антител. Дискриминация этих эффектов требует проведения дополнительных экспериментов по титрованию активных центров антител.
• Построение полной кривой титрования для каждой исследуемой сыворотки является довольно трудоемкой процедурой, требующей значительного расхода реагентов. В связи с этим часто целесообразнее использовать другой путь. В ИФА антител на основе статистической обработки кривых титрования многих сывороток определяют разведение, при котором значения регистрируемого параметра с известной вероятностью попадают на средний участок кривой титрования, где измерение наиболее достоверно. Это дает в дальнейшем возможность анализировать исследуемые сыворотки в одном разведении.
Определение соотношения P/N. При использовании ИФА в клинической практике необходимо стремиться к методической простоте и однозначности трактовки результатов анализа. В связи с этим широкое применение находит путь, основанный на измерении исследуемой сыворотки в одном разведении. Параллельно в том же разведении измеряют входящие в состав набора положительную и отрицательную контрольные сыворотки. В качестве критерия наличия антител используют отношение регистрируемых параметров для исследуемой (Р) и контрольной отрицательной (N) сыворотки. P/N, превышающее единицу, свидетельствует о наличии специфических антител. С учетом ошибок анализа и регистрирующего прибора обычно исследуемую сыворотку считают положительной при P/N^2. Относительный уровень содержания антител оценивают по приближению P/N к соответствующей величине положительного контроля.
