Генная инженерия растений. Лабораторное руководство - Дрейпер Дж.
ISBN 5-03-001854-9
Скачать (прямая ссылка):
селектируют практически так же, как описано для метода совместного
культивирования (разд. 2,9); при этом, разумеется, не добавляют
бактерицидные антибиотики, уничтожающие агробактерии. Таким образом,
после стимуляции включения ДНК клетки обрабатывают так же, как и любую
другую популяцию протопластов. Все проблемы, связанные с селекцией
трансформированных клеток, идентичны тем, которые возникают при работе с
клетками, трансформированными путем совместного культивирования с
агробактериями, и поэтому мы не будем возвращаться к их обсуждению.
3.1.5. Трансформация интактных растительных тканей DMGT-векторами
Трансформация протопластов DMGT-векторами с помощью какого-либо из
методов, перечисленных в разд. 3.1.2, может быть предпринята по отношению
к любому виду растений, для которого разработана система протопластов.
Однако даже в этом случае, если жизнеспособные протопласты, способные к
формированию клеточной стенки и делению, можно получить в достаточных
количествах, у многих культурных видов такие клетки не являются
тотипотентными. Таким образом, кроме работ по временной экспрессии,
трансформация протопластов с помощью DMGT-векторов в действительности не
вышла за пределы круга видов, чувствительных к агробактериям. Кроме того,
существуют и значительные основания предполагать, что прохождение клеток
через стадию недифференцированной культуры тканей тоже способно привести
к изменениям генотипа растения. По этим двум причинам многие лаборатории
в настоящее время разрабатывают методы трансформации, которые не нарушают
нормальное развитие и клеточный цикл растения.
3.1.5.1. Микроинъекции
Разработка техники микроинъекций оплодотворенных ооци-тов
революционизировала генную инженерию животных, и в настоящее время
существует громадный интерес к манипуляциям репродуктивным процессом
растений для целей трансформации путем микроинъекций микроспор,
созревающей пыльцы и незрелых зародышей [5].
Однако у этих подходов есть много нерешенных проблем, в том числе:
1. Трудность проникновения через растительную клеточную
стенку.
202
Глава 3
2. Проблемы определения тотипотентных клеток in planta и визуализации
клеточных ядер.
3. Плохая выживаемость и прекращение нормального развития культивируемых
клеток-мишеней, таких, как срезанные двухдневные незрелые зародыши и
созревающая пыльца, даже без микроинъекций.
4. Потеря эмбриогенного потенциала у изолированных микроспор большинства
культурных видов.
Улучшение методов микроинъекций и микрокультивирования или
использование систем оплодотворения in vitro в будущем позволит получать
растения из подвергшихся микроинъекциям незрелых и зрелых гамет, зигот
или ранних зародышей.
3.1.5.2. Методы доставки вектора с помощью "макроинъекций" и стрельбы
микрочастицами ("микросиарядами")
Во многих сообщениях 70-х годов предполагалось, что клетки растений
могут трансформироваться в результате пассивного поглощения ДНК
созревающими семенами или созревающей пыльцой в рыльце пестика. Однако
из-за отсутствия убедительных молекулярных доказательств результаты
большинства экспериментов, в которых объявлялось об успехе, считались
артефактами.
Многие из этих экспериментов в настоящее время воспроизводят с помощью
современных DMGT-векторов, несущих гены, которые легко анализировать
(например, pCaMVCAT), или которые сообщают доминантный селективный
фенотип трансформированным клеткам. Действительно, недавно было показано,
что клетки археспор ржи могут поглощать и интегрировать экзогенную
плазмидную ДНК, введенную в развивающийся цветковый побег [7]. Поскольку
клетки археспор дают начало га-метным тканям, трансформированные семена
образуются непосредственно после оплодотворения. Последние
идентифицировали путем проращивания в присутствии канамицина, и 7 из 3000
проростков оказались резистентными к антибиотику. Если будет доказана
воспроизводимость данного метода "макроинъекций", то он может найти
применение и в случае других видов растений.
Последняя разработка - это использование выдержанных в растворе
плазмидной ДНК вольфрамовых микрочастиц, чтобы "выстрелить" ДНК в большие
клетки эпидермиса лука [19]. Удается получить достаточно эффективную
временную экспрессию доставленных векторных последовательностей, но
остается выяснить, можно ли эту технологию применить к тотипотентным
клеткам культурных растений.
Методы, описываемые в данной главе, основаны на последних успешных
экспериментах по трансформации растений
Трансформация растительных клеток путем трансфекции ДНК
203
некоторых видов, и поэтому технологии макроинъекций и микроснарядов
обсуждаться не будут. Во всех приведенных ниже экспериментах используют
протопласты, полученные из суспензионной культуры клеток мутанта
альбиноса Petunia hybrida. Эти протопласты легко выделить в больших
количествах, они отличаются высокой выживаемостью и очень устойчивы к
процедурам введения ДНК. Следует отметить, что упоминаемые процедуры были
