Генная инженерия растений. Лабораторное руководство - Дрейпер Дж.
ISBN 5-03-001854-9
Скачать (прямая ссылка):
143
В описанных ниже экспериментах рассматривается трансформация клеток,
полученных из мезофильных протопластов табака и суспензионной культуры
клеток моркови; и то и другое можно считать модельными системами культуры
ткани.
1. Совместное культивирование отдельных клеток, полученных . из
протопластов табака с агробактериями. Клетки высевают
на чашки с высокой плотностью с последующей селекцией Ктг-
трансформантов при низкой плотности высева и регенерацией побегов табака
путем органогенеза.
2. Трансформацию небольших колоний суспензионной культуры клеток
моркови, высеваемых с низкой плотностью на "фидерные чашки", путем
совместного культивирования с агробактериями с последующей регенерацией
растений моркови через соматический эмбриогенез.
2.7. Выделение мезофильных протопластов табака
2.7.1. Основные положения
Растительный протопласт - это по существу клетка с удаленной
клеточной стенкой. При правильном культивировании протопласты табака,
например, будут заново синтезировать клеточную стенку и вступят в митоз.
Таким образом, культивирование протопластов - это удобный путь получения
популяций, состоящих из отдельных клеток. Процедура выделения
протопластов зависит от вида растения и природы исходного материала
(например, мезофилл листа, срезы проростков или культивируемые в
суспензии клетки). Протопласты обычно высвобождают из растительных тканей
путем расщепления клеточной стенки смесью пектиназ, целлюлаз и
гемицеллюлаз, растворенных в среде с высоким осмотическим давлением.
Такая среда сдерживает тургор и не дает клеткам лопнуть.
Методики выделения протопластов многих видов растений описаны в
литературе [26, 32]. На рис. 2.13 представлена общая схема выделения
протопластов из растительных тканей. У многих видов культурных растений
не определены благоприятные условия для восстановления клеточной стенки и
последующего деления выделенных протопластов. В случае других -
сообщалось о низкой частоте деления. Отметим, что для трансформации
необходимо использовать достаточно жизнеспособные протопласты, чтобы они
могли пережить совместное культивирование с агробактериями или физические
методы введения-ДНК, например микроинъекцию, электропорацию и химически
индуцированный эндоцитоз (гл. 3). Напомним, что разработка эффективной
системы получения протопластов у ранее неизучен-
144
Глава 2
А Мезофильная ткань листа
Б Суспензионная культура
В' Стерильный проросток: "ткань семядоли/корня
Стерилизуют поверхность листа и
удаляют нижний слой эпидермиса
Удаляют питательную среду
Приготовляют ~онкие срезы
Кусочки листа помещают (неповреждённой
стороной вверх) на раствор ферментов
Клетки/протопласты/ткань добавляют к
раствору фермента и инкубируют при медленном круговом вращении
Дважды отмывают в среде
для выделения протопластов (без фермента)
Фильтруют через тонкое сито и собирают на дне •центрифужной пробирки
Ресуспендируют в ростовой среде. Отмывают. Ресуспендируют в ростовой
среде
Подсчитывают количество протопластов, доводят плотность и высевают на
чашку в жидкой среде поверх агаризованной твердой среды
Рис. 2.13. Методы выделения, очистки и высева на чашки протопластов,
полученных' нз различных источников.
Трансформация клеток двудольных растений
145
ных видов (или даже различных разновидностей одного и того же вида!)
требует больших временных затрат и значительных усилий и должна
проводиться только в том случае, если другие пути получения
трансформантов не увенчались успехом. В частности, до сих пор не
удавалось эффективно регенерировать нормальные побеги из протопластов
основных видов злаковых и зерновых бобовых культур. Кроме того,
регенерация побегов остается проблематичной для многих овощных и фуражных
бобовых культур, несмотря на то что для них были успешно разработаны
системы протопластов. В приведенном эксперименте в качестве модельной
системы используется выделение и культивирование мезофильных протопластов
из листьев N. tabacum (сорт SR1).
2.7.2. Обеспечение
Оборудование и. приспособления
- Обычные материалы для культуры тканей (приложение2[1])-
- Листья табака сорта SR1 или Xanthi (еще не вполне распустившиеся).
- Гемоцитомер (конструкции Фукса - Розенталя).
- Инвертированный фазово-контрастный микроскоп с объективами х Ю, Х20 и
Х40, Nicon Diaphot (или эквивалентный).
- Дощечки с названием растения.
- Термостат на 25 °С без освещения.
- Настольная центрифуга MSE Centaur 2 (или эквивалентная) с бакет-
ротором для центрифужных пробирок, описанных ниже.
- Стерильные центрифужные пробирки (например, пробирки
из пирекса с закручивающимися крышками 16x120 мм или полистироловые
пробирки Sarstedt, тип 55.468/001, 16Х
