Генная инженерия растений. Лабораторное руководство - Дрейпер Дж.
ISBN 5-03-001854-9
Скачать (прямая ссылка):
видов растений корончатые галлы или косматые корни развиваются на больших
эксплантатах, культивируемых на простых средах, не содержащих
фитогормонов. Главное требование к ростовой среде, используемой при
трансформации и развитии опухоли, заключается в том, чтобы она
обеспечивала жизнеспособность эксплантата при ограниченном образовании
каллуса. При использовании небольших эксплантатов в состав среды можно
включить и микродобавки ростовых веществ, чтобы сохранить эксплантат и
обеспечить ограниченное деление окружающих рану клеток во время инкубации
с агробактериями. Проблему выживаемости эксплантата можно решить,
Трансформация клеток двудольных растений
109
помещая в среду большое количество небольших эксплантатов, чтобы
поддерживать высокую плотность инокулируемого растительного материала.
Следует подчеркнуть, что большинство тканей корончатых галлов и косматого
корня после срезания с поверхности эксплантатов способны расти на простых
средах, часто не содержащих фитогормонов и содержащих антибиотики,
которые инактивируют бактериальные, но не растительные клетки (приложение
2[IIIJ). Таким образом, для спасения трансформантов редко требуются
сложные среды, что оставляет достаточно возможностей для эмпирического
подбора сред.
Поскольку физиологически и морфологически нормальные растения
невозможно регенерировать из онкогенных клеток корончатых галлов,
большинство современных векторов на основе Ti-плазмид неонкогенны. Как
упоминалось выше, главная особенность онкогенных систем трансформации с
помощью агробактерий состоит в том, что галлы п косматые корни вырастают
из эксплантатов, и, следовательно, трансформированные клетки легко
отличить. Это очень важное свойство, поскольку трансформация эксплантатов
с помощью неонкогенных векторов часто не позволяет отобрать резистентные
к антибиотику ткани на фоне нетрансформированных клеток. Таким образом,
онкогенные векторы, которые к тому же несут гены устойчивости к
антибиотикам [38, 39], очень полезны для быстрого подбора наилучших
эксплантатов и методик инокуляции, чтобы получить оптимальную
трансформацию. Индукция "микроопухолей" в местах поранения с большой
площадью поверхности, таких, как срезы клубня или главного корня (рис.
2.7), тоже представляет собой удобный способ получения . нескольких тысяч
легко отличимых, независимых трансформантов.
Ситуация слегка отличается при использовании Ri-плазмид
A. rhizogenes, поскольку у некоторых видов можно регенерировать
трансформированные побеги из культивируемых косматых корней [77, 55, 57,
46, 69J. Точно так же оказалось возможным регенерировать
трансформированные побеги внешне нормального вида из некоторых
"полуонкогенных" корончатых галлов, индуцированных агробактериями,
несущими "побеговые" мутанты Ti-плазмид [23], а также в некоторых случаях
из корончатых галлов дикого типа, когда индуцирующий штамм агробактерий
секретировал большое количество цитокинннов [27J. Как подчеркивалось в
общем введении к данной главе (разд. 2.1.3.4), в последнее время в
различных источниках описана регенерация неонкогенных, устойчивых к
антибиотику побегов из опухолей, при индукции которых в качестве ut'r-
помощ-ника для бинарного вектора использовали онкогенные Ti- или Ri-
плазмиды дикого типа, хотя пока не ясно, насколько широко будет
распространено это явление.
110
Глава 2
Цель последующих экспериментов заключается, во-первых, в определении
локализации в эксплантатах клеток, которые переходят к делению,
связанному с раневым ответом, и подтверждении того, что подобные клетки
могут находиться в состоянии компетентности для трансформации, и, во-
вторых, в изучении влияния эксплантата и штамма агробактерий на
образование опухолей корончатого галла и косматого корня. Такие
эксперименты можно проводить на любом эксплантате выбранного вида
растений, а не только в описанных ниже условиях.
Рис. 2.7. Индукция опухолей Agrobacterium tumefaciens и A. rhizogenes на
эксплантатах запасающих органов. Показаны эксплантаты через три недели
после инокуляции. <4. МорковьХнеонкогенный штамм A. tumefaciens С58С1
(pGV3850). Б. МорковьХонкогенный штамм нопалинового типа A. tumefaciens
pTiB6S3 : : pM()N200. В. СвеклаХрТШбСЗ : : рМ01ч'200. Г. КартофельХштамм
A. rhizogenes дикого типа А4. Д. МорковьXЛ. rhizogenes штамм А4. Е.
Увеличен тот же самый диск, что и на предыдущем снимке (Д); после
инкубации
в течение еще 2 иед.
2.2.2. Обеспечение
Оборудование и расходуемые материалы
-Обычные материалы для работы с культурой ткани (приложение 2[1]).
- Эксплантаты, приготовленные, как описано в приложении 2[I VJ.
А. Стерильные проростки (например, лен, горох, Brassica па-pus и свекла).
Трансформация клеток двудольных растений
111
Б. Стерильные культуры побегов (например, N. tabacum, Petunia и
картофель), полученные путем размножения пазушных почек.
В. Срезы запасающих органов моркови (главного корня), свеклы (разбухшего
