Генная инженерия растений. Лабораторное руководство - Дрейпер Дж.
ISBN 5-03-001854-9
Скачать (прямая ссылка):
определенного соотношения /: i.
[ДНК] = --М, когда ? = 2N0MxlO~3 концов/мл,
или
[ДНК] = -X--^-М, когда i = N0MX10'3 концов/мл.
/ MW*
На практике ситуация гораздо более сложна, чем описанная выше.
Используемые для клонирования в плазмидах фрагменты довольно коротки для
модели стохастического клубка, чтобы можно было точно предсказывать их
поведение, и обычно ока-
56
Глава 1
зывается, что при j:i= 1 доминируют линейные конкатемеры. Лигирование
обычно проводят между молекулами неодинаковой длины с различными
величинами /. Поэтому для получения нужных продуктов необходимы различные
концентрации концов этих молекул. При клонировании в плазмидах требуемый
конечный продукт обычно представляет собой кольцевой гетеродимер, для
получения которого необходима компромиссная величина между низким
соотношением j: i, чтобы стимулировать первоначальное межмолекулярное
лигирование, и высоким отношением /: t, стимулирующим последующее
образование колец. Кроме того, соотношение j: i будет изменяться в
процессе реакции: i уменьшится, поскольку концы станут лигированными
и, следовательно, недоступными в качестве субстрата, а / уменьшится,
поскольку молекулы становятся длиннее. В результате лигирования j:i
увеличивается и вероятность циркуляризации повышается.
Эмпирически оптимальное соотношение j: i для образования кольцевых
гетеродимеров приближается к 2 и его обычно вычисляют для меньшей из двух
молекул. Примечание: не забывайте, что i - это полная концентрация концов
каждого типа и, следовательно, вклад в нее дают оба типа присутствующих
фрагментов. Поскольку нужный продукт содержит одну молекулу вектора и
одну вставки, они должны присутствовать в одинаковых молярных
концентрациях.
Для увеличения выхода кольцевых гетеродимеров используют различные
стратегии, одна из которых, дефосфорилирование, описана в разд. 1.5.3.
Данные методы обычно предотвращают замыкание в кольцо одного или обоих
фрагментов до того, как произойдет межмолекулярная реакция. В случае,
если один из наборов фрагментов не содержит немодифицированных самоком-
плементарных концов, эти методы позволяют проводить лигирование при более
высоких величинах /: г, чтобы увеличить образование колец рекомбинантных
молекул.
Использование приведенных выше уравнений иллюстрируется следующим
примером, в котором фрагмент СаМ\-cat размером 4,6 т. п. н. из
гидролизованной Hindlll pUC18CaMVCAT лигируют в дефосфорилированный
Hindlll сайт плазмиды pBin 19 с образованием pBin 19 СаМV-cat.
Рестрикционные карты обеих плазмид и стратегия клонирования представлены
на рис. 1.7. Необходимые свойства векторной плазмиды и вставки
представлены в табл. 1.3.
Чтобы получить максимальный выход нужных кольцевых гетеродимеров,
важно, чтобы немодифицированная вставка присутствовала в реакции
лигирования в правильном соотношении /: г. Поскольку вектор модифицирован
щелочной фосфатазой, он может быть лигирован только с ^модифицированными
концами
Агробактериальные трансформирующие векторы растений 57
Таблица 1.3. Свойства векторной плазмиды и вставки
Фрагмент Размер Мол, масса (концов/мл)
(Т. П. H.)
CaMV-cat X Hiti d 111 4,6 ЗДХ106 1,1X101S
pBinl9x#w!dIII 10,0 6,7 XI 0s 3.6ХЮ12
вставки и, следовательно, соотношение /: i для вектора Не имеет значения.
Однако нужный продукт реакции содержит одну молекулу вектора и одну
вставки, следовательно, они должны присутствовать в реакции лигирования в
эквимолярных соотношениях. Концентрация ДНК, необходимая для получения
j:i = 2 для вставки:
[ДНК] = -Х--------------м = 4,7X10-" м.
2 (3,1х 10е) з/г ^
Поокольку необходимое соотношение молекул вектора и вставки
составляет 1 : 1, каждый из фрагментов должен присутствовать в
концентрации
1^^М = 2,ЗХЮ-9 М.
Следовательно, 20 мкл лигируемой смеси должны содержать
4,7Х10-9ХЗДХ106Х20 мкг = 291 нг вставки (CaMV-caty^Hind III)
4,7X10"9X6,7XI06X20 мкг = 630 нг вектора (pBinl9yHind III)
Аналогичные вычисления можно использовать для определения условий
лигирования при клонировании того же фрагмента в малый промежуточный
вектор перед его коинтеграцией на более позднем этапе с хелперной
игг^плазмидой, такой, как PGV3850.
Не все полученные в процессе лигирования рекомбинантные молекулы ДНК
будут удовлетворять задаче эксперимента. По окончании лигирования
обнаруживаются разнообразные молекулы, включая мультимеры вставок или
вектора, лигированные на себя последовательности вектора и делетированные
молекулы, образующиеся при действии на ДНК нуклеаз. После трансформации
Е. coli (разд. 1.7) лигированными молекулами необходимо идентифицировать
колонии, содержащие рекомбинантные молекулы ДНК нужного типа. Этот обычно
двухступенча-
58
Глава 1
тый процесс вначале предусматривает идентификацию бактериальных колоний,
