Генная инженерия растений. Лабораторное руководство - Дрейпер Дж.
ISBN 5-03-001854-9
Скачать (прямая ссылка):
компонент (разд. 6.9.4), либо использовать какой-либо другой флуорогенный
субстрат, синтезированный фирмой Molecular Probes Inc. В частности, из
резоруфинглюкуро-нида (ReG) образуется резоруфин, квантовый выход
которого необычайно высок. Длины волн его возбуждения (570 нм) и
излучения (590 нм) удобны тем, что лежат в такой области спектра, где
ткани растений практически не поглощают и не флуоресцируют. Кроме того,
максимальная флуоресценция достигается при нейтральном pH, делая ненужной
остановку реакции. Все сказанное справедливо и для 3-
карбоксиумбеллиферил-глюкуронида (CUG). Образующийся из этого соединения
3-карбоксиум-беллиферон (3-CU) возбуждается при 400 нм н излучает при 445
нм. Преимущества 3-CU перед 4-MU состоят в том, что интенсивность его
флуоресценции гораздо выше (Jefferson, неопубликованные данные). Фирма
Molecular Probes Inc. скоро будет продавать CUG.
*> Обычно измеряют активность GUS, а затем данные по каждому образцу
соотносят с количеством ДНК либо хлорофилла (для изолированных
хлоропластов) в экстракте. Приблизительно содержание ДНК можно оценить
путем измерения флуоресценции красителя Hoechst 33258, как описано в
литературе [32].
6.9.6. Выявление GUS in situ с использованием денатурирующего
полиакриламидного геля
6.9.6.1. Общие положения
Активность GUS можно выявить in situ среди фракционированных белков
после денатурирующего гель-электрофореза экстрактов. Такой подход
помогает изучать белки, образующиеся в результате трансляционного
слияния, а также посттрансля-ционный процессинг белков, например
отщепление транзитных пептидов после переноса продукта химерного гена
cab-GUS в хлоропласты. Аналогичный анализ химерного гена РБФК МC-npt-ll
описан в разд. 6.7, в котором и приведены более подробные детали
приготовления и проведения электрофореза в ПА А Г.
372
Глава в
6.Э.6.2. Обеспечение
Оборудование и расходуемые материалы
- Обычное оборудование для молекулярно-биологических исследований
(приложение 1 [I]).
- Оборудование и расходуемые материалы для электрофореза в ПААГ (разд.
6.7.2.1).
- Пластмассовая коробка по размеру геля (Steward Plastics).
- Емкость со льдом достаточно большого размера, чтобы в иее помещалась
пластмассовая коробка.
- Качающаяся платформа или круговая качалка с низкой скоростью вращения.
- Стеклянная пластинка того же размера, что и разделяющий ПААГ.
- Термостат на 37°С.
- УФ-трансиллюминатор, дающий УФ-излучение с длиной волны около 360 нм
(UV Products).
- Фотокамера "Поляроид" с фильтром "Кодак 2Е Wratten"-(или аналогичным).
Растворы
- Растворы для заливки 7,5%-"ого ПААГ с 0,1% ДСН, как описано в разд.
6.7.2.1.
Буфер с ДСН для нанесения образца (62,5 мМ трис-HCl;
0,23%-ный ДСН, 10%-ный глицерин; 50 мМ р-МЭ; 0,001%-
ный бромфеноловый синий).
На 100 мл:
1 М Трис, pH 6,8 6,25 мл
ДСН (Sigma) 0,23 г
Глицерин (BDH Analar) 10,0 мл
В-МЭ (Sigma) 348,0 мкл
Бромфеноловый синий (Pharmacia) 1,0 мг.
- Буфер для экстракции GUS (разд. 6.Э.5.2).
- Буфер для флуориметрического определения GUS (разд~ 6.9.5.2).
- Пульверизатор с 0,2 М Na2C03.
6.9.6.3. Методика
Лр имечание: детали проведения электрофореза в ПААГ изложены в разд. 6.7.
1. Заливают 7,5%-ный полиакриламидный гель, содержащий
0,1% ДСН, как описано в разд. 6.7.2.3.
2. Инкубируют экстракты растений (10-50 мкл) с равным объемом буфера для
нанесения образцов, содержащего ДСН,. при комнатной температуре примерно
10-15 мин.
Анализ организации и экспрессии генов растений
373
3. Проводят электрофорез образцов при комнатной температуре в течение
ночи при 50 В. Разбирают прибор, удаляют концентрирующую часть геля
(разд. 6.7.2.3) и помещают разделяющую часть геля в пластмассовую
коробку.
4. Осторожно промывают гель 4 раза на медленно качающейся платформе или
круговой качалке в 100 мл буфера для экстракции GUS в течение 2 ча>.
5. Инкубируют гель на льду в течение 30 мин в буфере для
флуориметрического определения GUS.
6. Переносят на стеклянную пластинку и удаляют весь буфер с поверхности
геля6). Инкубируют при 37 °С примерно 10- 30 мин (в зависимости от
необходимой чувствительности).
7. Слегка опрыскивают гель 0,2 М Na2C03 и осматривают его под
длинноволновым УФ-трансиллюминатором (360 нм).
1 2 3 4 5 в 7
GUS
Рис. 6.19. Определение GUS в ПААГ с ДСН. Дорожки 1 и 2- экстракты из
растений табака, трансформированных МС РБФК/0-GXJS (рВ1 131), 3-5 -
растения, трансформированные CaMV-GUS (pBI 121). Дорожки 6 и 7 -
нетрансформированные растения табака.
8. Фотографируют гель, используя фильтр "Кодак 2Е Wratten".
Чувствительность такого определения достаточно высока, чтобы обнаружить
до 0,2 нг GUS; это сравнимо с чувствительностью вестерн-блоттинга(r)).
9. Пример эксперимента по выявлению GUS in situ в полиакриламидном геле,
