Генная инженерия растений. Лабораторное руководство - Дрейпер Дж.
ISBN 5-03-001854-9
Скачать (прямая ссылка):
приготовлены из различных источников, как описано в разд. 6.6.
- Трансгенные растения табака SR1, несущие ген МС-npt-II.
- Трансгенные растения SR1, содержащие конститутивно экспрессируемый ген
npt-II без последовательности транзитного
пептида (nos-npt-II).
- Контрольные нетрансформированные растения табака SR1.
Тотальный белок, выделенный из растений каждого типа и
из ткани листа, фракционируют методом электрофореза в неденатурирующем
полиакриламидном геле (разд. 6.7.2) и проводят сравнение активности NPT-
II методом радиоавтографии in situ (разд. 6.7.3).
6.6. Выделение интактных хлоропластов табака
6.6.1. Общие положения
Интактные хлоропласты можно выделить из листьев табака путем простой
гомогенизации и очистки в ступенчатом градиенте плотности фиколла (см.
также разд. 4.5). После обработки протеиназой для удаления примесей
белков цитоплазмы, включая вновь синтезированную NPT-II, хлоропласты
лизируют и изучают ассоциированную с ними ферментативную активность.
344
Глава 6
Описанный ниже метод можно применять для выделения хлоропластов из многих
видов растений, а также для изучения других
белков хлоропластов.
6.6.2. Обеспечение
Оборудование и расходуемые материалы
- Обычное оборудование для молекулярно-биологических исследований
(приложение 1 [I]).
- Политрон (Gallenkamp).
- Листья табака.
A. Растения, трансформированные геном МС-npt-II.
Б. Растения, трансформированные геном nos-npt-II.
B. Контрольные растения (нетрансформировавные SR1).
- Стерильные универсальные флаконы (Sterilin).
- Нетканый материал для фильтрования Miracloth (Cal-biochem) или капрон.
- Настольные центрифуги с охлаждением и бакет-ротором (например,
Sorval).
Растворы
- 2,0 М HEPES-KOH, pH 7,5; растворяют 476,0 г в 500 мл дистиллированной
Н20. Доводят pH до 7,5 1,0 М КОН и доливают до 1 л дистиллированной НгО.
- Пятикратный буфер для выделения хлоропластов (CIB) [1,65 М сорбитол;
250,0 мМ HEPES-KOH, pH 7,5; 5,0 мМ MgCl2; 5,0 мМ МпС12; 10,0 мМ ЭДТА;
5,0%-ный (объем на объем) 2-МЭ; 2,5 мг/мл БСА]. На 100 мл:
Сорбитол 30,0 г
2,0 М HEPES-KOH, pH 7,5 12,5 мл
MgCl2-6H20 101,5 мг
МпС12-4Н20 98,5 мг
0,5 М ЭДТА 2,0 мл
2-МЭ 5,0 мл
БСА 250,0 мг
Хранят при -20 °С. Для получения однократного CIB используют
дистиллированную воду.
- Раствор трипсина: 15 мг/мл трипсина (Sigma) в однократном CIB.
- Буфер для лизиса (25,0 мМ трис-HCl, pH 7,5; 0,5%-ный 2-МЭ; 25,0 мкл/мл
ингибитора трипсина). На 10 мл:
2,0 М трис-НС1, pH 7,5 125,0 мкл
2-МЭ 50,0 мкл
Ингибитор трипсина (Sigma) 250,0 мкг.
- 10%- и 3%-ный фиколл (Pharmacia 17-0400-01 или Sigma F-4375)
растворяют в однократном CIB.
Анализ организации и экспрессии генов растений
345
6.6.3. Методика
Примечание: все работы проводят при 0-4°С. Все процедуры следует
производить быстро и аккуратно, особенно важно нарезать лист на кусочки
непосредственно перед началом гомогенизации.
Приготовление градиентов фиколла
1. Пипеткой на 10 мл осторожно (не касаясь стенок) наливают 10 мл 10%-
ного раствора фиколла на дно универсального флакона.
2. Наслаивают на этот раствор 3%-ный фиколл, используя шприц на 20 мл с
иглой, изогнутой в форме буквы U. 3%-ный фиколл наслаивают осторож"о,
поднимая иглу по мере того, как поднимается уровень жидкости. На поршень
необходимо нажимать очень слабо. Граница должна быть четкой и хорошо
различимой.
3. Наслаивают на 3%-ный фиколл 5 мл однократного CIB и
охлаждают до 4°С.
Следует соблюдать осторожность, чтобы не перемешать градиент при
перемещении пробирок.
Приготовление образца
1. Собирают по 2 г молодых листьев каждого растения. Охлаждают в воде
со льдом в течение 2-3 мин. Быстро нарезают каждый лист на маленькие
кусочки новым скальпелем (лезвием), избегая сдавливания, и сразу же
переносят в пластмассовые флаконы, содержащие 15 мл однократного CIB,
охлажденного до температуры льда. Измельчают на большой скорости в
гомогенизаторе "Политрон" 1-2 раза по 5 с.
2. Быстро фильтруют гомогенат через два слоя Miracloth в
пластмассовый флакон.
3. Осаждают неочищенный препарат хлоропластов центрифугированием
(настольная центрифуга с охлаждением типа Sorval с бакет-ротором) при
3000 об/мин и 2°С в течение
3 мин.
4. Снова суспендируют осадок в 20 мл охлажденного до 4 °С
однократного CIB, осторожно перемешивая его пастеровской пипеткой, и
вновь осаждают хлоропласты при 3000 об/мин и 2°С в течение 3 мин.
5. Ресуспендируют неочищенный препарат хлоропластов в 2 мл
однократного охлажденного CIB (стадия 4).
6. Осторожно переносят пипеткой 2,0 мл суспензии хлоропластов на
поверхность градиента фиколла и центрифугируют при 3000 об/мин и 2°С в
течение 5 мин.
7. Укороченной (с широким носиком) пастеровской пипеткой
346
