Генная инженерия растений. Лабораторное руководство - Дрейпер Дж.
ISBN 5-03-001854-9
Скачать (прямая ссылка):
= 500 нг (в каждой реакции используют 10 нг).
Таким образом, в кусочке агарозы весом 100 мг содержится такое количество
ДНК вставки, которое достаточно для проведения - = 50 реакций.
Следовательно, объем агарозы, ис-10
пользуемый в одной реакции=- =2,0 мкл. Смесь ДНК встав-
50
ки и агарозы будем в дальнейшем называть исходной пробой. Реакция мечения
Одну и ту же исходную пробу можно использовать несколько раз без
снижения эффективности мечения следующим образом:
1. Прогревают исходную пробу в течение 5 мин на кипящей водяной бане3*.
2. Переносят пробирку на 5-10 мин в водяную баню на 37 °С. За это время
смешивают следующие вещества в пробирке Эппендорф объемом 1,5 мл:
Буфер OLB для мечения 3,0 мкл БСА 0,6 мкл
32P-dCTP 1,5 мкл
Фрагмент Кленова ДНК-полимеразы I 0,6 мкл.
Следует убедиться, что все компоненты смеси находятся на дне пробирки
(при необходимости центрифугируют) и добавить ДНК.
Анализ ДНК путем рестрикции и гибридизации по Саузерну
301
Исходная проба 2,0 мкл (10 нг).
Доводят до 15 мкл стерильной дистиллированной НгО
(7,3 мкл).
3. Быстро перемешивают встряхиванием (избегая избыточного вспенивания)
и центрифугируют в течение 2 с, чтобы собрать капли на дне пробирки.
Оставшуюся исходную пробу помещают до следующего раза в морозильник.
4. Помещают пробирку в надписанный свинцовый контейнер й затем
инкубируют при комнатной температуре в течение 5 чб>.
5. Останавливают реакцию, добавив 85 мкл стоп-раствора.
6. Отбирают аликвоту (1-5 мкл) для измерения включения метки в пробу
(приложение 5[Ш]).
7. Кипятят пробу (5 мин), быстро охлаждают на льду и добавляют(r)' в
гибридизационную смесь.
Примечания
а> Это приводит к расплавлению агарозы, высвобождению и денатурации
днк.
б> Реакция выходит на плато примерно через 4-5 ч, однако, если это
удобно, можно оставить на ночь. в) Мечение происходит весьма
эффективно, и, таким образом, в отличие от ник-трансляции нет
необходимости избавляться от 32P-dCTP перед внесением ДНК-пробы в
гибридизационную смесь. Хотя реакция хорошо воспроизводится, часто
необходимо измерить включение 32P-dCTP в ДНК-пробу, как описано в
приложении 5 [III]. В результате удельная активность превышает Ю9
имп/мин/мкг.
Приложение 5 [I]
Буферы для рестриктаз
Десятикратный буфер для ?coRI:
1,00 М трис-НС!
0,50 М NaCl 0,10 М MgCl2 pH 7,5.
Десятикратный буфер для HindiII: 0,10 М трис-НС1
0,50 М NaCl
0,10 М MgCl2
0,14 М дитиотреитол (ДТТ) pH 7,5.
302
Глава 5
Приложение 5 [II]
Концевое мечение маркеров, полученных на основе ДНК фага X
1. В стерильной пробирке Эппендорф смешивают следующие-реагенты:
2. Помещают пробирку в надписанный свинцовый контейнер "
инкубируют 5 ч.
3. Останавливают реакцию, добавив 85 мкл стоп-раствора (разд. 5.6.2).
4. Отбирают аликвоту (1-5 мкл) для измерения включения метки в пробу
(приложение 5[Ш]).
Примечание: ДНК фага X ни до, ни после мечения нельзя• кипятить.
5. Наносят 5ХЮ4 имп/мин на одну дорожку агарозного геля.
6. Для повышения стабильности следует предварительно экстрагировать
маркеры фенолом, как описано в разд. 1.8.3-(стадии 10-16).
Примечание
*> Получают, смешивая растворы А и В для мечения в соотношении 2:5.
Приложение 5 [III]
Определение включения метки в ДНК
Способ А
1. Наносят определенный объем (до 10 мкл) образца в центр* стеклянного
фильтра GF/C (Whatman) диаметром 2,4 см. При использовании
олигонуклеотидов (разд. 5.6) 15 мкл реакционной смеси доводят до 100 мкл,
добавляя 85 мкл стоп-раствора (или раствора для гибридизации), и 1 мкл
наносят на фильтр.
2. Переносят пипеткой такой же объем (1 мкл для ДНК, меченной с
использованием олигонуклеотидов) образца в пробирку Эппендорф, содержащую
500 мкл раствора ДНК. из спермы лосося или сельди (500 мкг/мл в 20 мМ
ЭДТА)..
ДНК фага X, обработанная Hindlll Буфер АВа)
БСА (10 мкг/мл)
32P-dCTP
1,0 мкг см. разд. 5.3 примечание з)
Фрагмент Кленова Дистиллированная НгО
3.0 мкл
0,6 мкл
1.0 мкл см. разд. 5.6.2
0,2 мкл
до 15,0 мкл
Анализ ДНК путем рестрикции и гибридизации по Саузерну
303
Добавляют 125 мкл 50%-ной ТХУ, охлажденной до 0°С, перемешивают и
охлаждают на льду в течение 5 мин.
3. Собирают осадок фильтрованием через GF/C на специальной установке
под вакуумом. Дважды промывают осадок 5 мл 10%-ной ТХУ, охлажденной до
0°С, и затем дважды
5 мл 100%-ного этанола.
4. Высушивают оба фильтра и измеряют радиоактивность в жидком
сцинтилляторе. Непромытый фильтр позволяет определить внесенную
радиоактивность, а промытый фильтр - включившуюся метку.
5. Вычисляют процент включения и удельную активность (имп/мин/мкг) ДНК
пробы.
Способ Б
1. Наносят 1-2 мкл в центр каждого из двух бумажных дисков Whatman DE-
81 диаметром 2,4 см.
2. Промывают один из фильтров пять раз в 0,5 М NajHPCU (5 мин на
