Генная инженерия растений. Лабораторное руководство - Дрейпер Дж.
ISBN 5-03-001854-9
Скачать (прямая ссылка):
тРНК не связываются на колонках с oligo(dT)-целлюлозой или poly(и)-
сефарозой и смываются с них. Связанную мРНК можно затем элюировать
буферами с низкой ионной силой. Метод обогащения препарата РНК фракцией
poly(А)+-мРНК приведен ниже.
Хороший способ проверки чистоты препаратов мРНК -это определение
эффективности их трансляции in vitro в бескле-точной белоксинтезирующей
системе [11]. Это особенно важно в случае РНК, подлежащей дальнейшему
фракционированию и использованию для синтеза кДНК- Размер РНК можно
установить, сравнивая ее с маркерными молекулами при электрофорезе в
полиакриламидном геле. Специфические транскрипты .в препаратах можно
обнаружить с помощью нозерн-блоттинга (приложение 6 [I]).
4.8.2. Обеспечение
Оборудование и расходуемые материалы
- Обычное оборудование для молекулярно-биологических исследований
(приложение 1 [I]).
- Стерильные силиконированные пастеровские пипетки.
- Зажим и штатив.
- Полипропиленовое волокно (Supa Aquatic Supplies Ltd., синтетическое
волокно для фильтрования). Перед работой промывают и автоклавируют.
- Водяная баня на 65 °С.
-- Кварцевые микрокюветы (объемом 300 мкл). Хранят в концентрированной
НС1. Перед использованием тщательно промывают стерильной дистиллированной
водой.
- Oligo(dT)-целлюлоза (Sigma).
- Абсолютный спирт.
Растворы
- Буфер для нанесения (20 мМ трис-НС1, pH 7,6; 0,5 М LiCl; 1 мМ ЭДТА;
0,1% ДСН). На 100 мл:
2,0 М трис-НС1, pH 7,6 1,0 мл
LiCl (BDH Analar) 2,12 г
¦0,5 М ЭДТА 0,2 мл
10%-ный ДСН 1,0 мл
272
Глава 4
Перед использованием автоклавируют и хранят при комнатной температуре.
- Буфер для элюции (10 мМ трис-HCl, pH 7,6;. 1 мМ ЭДТА;
0,05% ДСН).
На 100 мл:
2,0 М трис-HCl, pH 7,6 0,5 мл
0,5 М ЭДТА 0,2 мл
10%-ный ДСН 0,5 мл.
Автоклавируют и хранят при комнатной температуре.
- 4 М ацетат натрия, pH 6,0.
4.8.3. Методика
1. Суспендируют необходимое количество oligo(dT)-целлюлозы (5-15 мг) в 2
мл стерильного буфера для нанесения в стерильной пробирке из корекса.
Дают целлюлозе осесть, сливают супернатант и продолжают суспендировать в
стерильном буфере для нанесения до тех пор, пока супернатант не станет
абсолютно прозрачным. Переносят взвесь в стерильные силиконированные
пастеровские пипетки, пред-варительно заткнутые стерильным
полипропиленовым во-локнома>. В описанном ниже примере 5 мг РНК
растворяют в 1 мл буфера. Это количество можно нанести на колонку объемом
200-250 мкл, содержащую 5-10 мг oligo(dT)-целлюлозы6). Необходимо
убедиться, что в колонке отсутствуют пузырьки воздуха (уплотнять нельзя)
и ни в коем случае не следует допускать пересыхания колонки. Промывают 10
мл буфера для нанесения. Скорость выведения должна составлять одну каплю
в течение 1-5 с и может регулироваться изменением плотности фильтра либо
диаметра колонки (т. е. фильтр может располагаться выше или ниже в месте
расширения пастеровской пипетки).
2. Отбирают две аликвоты по 0,5 мл раствора РНК (5 мг) и к каждой
добавляют по одному объему двукратного буфера для нанесения. Прогревают
(65 °С, 7 мин) и затем помещают на 5-10 мин на лед.
3. Пропускают через колонку последнюю порцию буфера для нанесения и сразу
же наносят на колонку препарат РНК в объеме 2 мл. Собирают элюат в ту же
пробирку Эппендорф и еще шесть раз повторяют нанесение на колонку.
4. Промывают колонку 10-100 млв) буфера для нанесения, чтобы смыть тРНК и
рРНК-
5. Нагревают буфер для элюции до 45°С. Промывают колонку последней
порцией буфера для нанесения, наносят на колонку пять раз по 200 мкл
буфера для элюции. Собирают аликвоты (5X300 мклг)) выходящей poly(А)+-
мРНК в пробирки Эппендорф.
Выделение нуклеиновых кислот из клеток растений
273
6. Измеряют при 260 нм концентрацию ро1у(А)+-мРНК (1,0 OD26o=37 мкг/мл).
7. Добавляют 4 М ацетат натрия, pH 6,0, до конечной концентрации 0,2 М,
перемешивают и осаждают мРНК 2,5 объемами абсолютного спирта. Препарат
хранят под этанолом при -70 °С.
8. При необходимости центрифугируют пробирки Эппендорф в мини-центрифуге
в течение 5 мин, сливают этанол и высушивают осадок в эксикаторе.
Суспендируют ро1у(А)+-мРНК в стерильной дистиллированной воде в
концентрации
0,2 мкг/мкл.
Примечания
а) Данный метод можно использовать для получения как больших, так и?
незначительных количеств РНК. В приведенной методике колонку делаюг из
стерильной силиконированной пастеровской пипетки, у которой
непосредственно перед сужением капилляра расположен фильтр из небольшого
кусочка стерильного полипропиленового волокна. С фильтром следует
обращаться осторожно и не сжимать его слишком сильно.
б> Для синтеза кДНК необходимо вновь очистить мРНК и получить, poly (А)
++-мРНК
в) Для анализа препаратов poly (А) +-мРНК методом нозерн-блоттинга
достаточно промыть колонку 10 мл буфера для наиесения (см. приложение
6[1]). В случае синтеза кДНК это следует делать тщательнее, используя до
