Ферменты 2 - Диксон М.
Скачать (прямая ссылка):
это FAD, Е - апофермент. Окисление D-аланина кислородом катализирует
только EF, а Е и F по отдельности не обладают активностью. Диссоциация EF
на Е и F при разбавлении является обратимой, сопровождается падением
активности и завершается в течение нескольких минут. При добавлении
достаточного количества F и Е происходит образование EF и восстановление
активности, однако этот процесс также требует некоторого времени. На рис.
8.55 представлены три кривые уменьшения концентрации О2 в ходе
ферментативной реакции. Изменение концентрации Ог регистрировалось с
помощью кислородного электрода. Кривая / получена при следующих условиях:
0,025 мл исходного раствора EF добавляли к 4 мл буферного раствора и
перед добавлением субстрата (аланина) инкубировали в течение 12 мин для
того, чтобы процесс диссоциации фермента достиг равновесия. Кривая III
получена в тех же условиях, что и кривая /, за исключением того, что EF и
аланин добавляли одновременно в момент времени, указанный на рисунке
стрелкой. Видно, что реакция вначале протекает быстро, однако затем
скорость ее уменьшается по мере диссоциации EF. Кривая II получена в тех
же условиях, что и кривая /, но в момент времени, указанный другой
стрелкой, в реакционную смесь добавляли избыток F; наблюдается весьма
быстрое (но не мгновенное) ускорение реакции по мере образования EF,
которое продолжается до тех пор, пока скорость реакции не становится
равной по величине начальной скорости на кривой III.
На рис. 8.56 представлены кривые изменения активности
Ингибирование и активация ферментов
649
оксидазы D-аминокислот во времени после разбавления фермента в
присутствии различных концентраций F. Кривые характеризуют равновесное
превращение EF^E + F.
В рассмотренной ранее согласованной модели кооперативности [3217], как и
в реакционной схеме (8.399), предполагается, что фермент может находиться
в различных конформационных состояниях. В отличие от механизма (8.399)
согласованная модель рассматривает ферменты, состоящие из нескольких
субъединиц. Для ферментов, функционирующих в соответствии с этой моделью,
могут наблюдаться гистерезисные эффекты, если аллостерический переход
является относительно медленным. Глицеральдегидфосфатдегидрогеназа (КФ
1.2.1.12) из дрожжей функционирует по приведенной на рис. 8.57
согласованной модели, в которой переход между R- и Т-состояниями фермента
является относительно медленным процессом (t" " 0,5 с); данные в пользу
такой модели получены методом температурного скачка и обсуждались на с.
619-620. Расчет отдельных констант скорости из данных по изучению
кинетики релаксации показал, что в отсутствие NAD+ фермент находится
почти полностью в состоянии Т (L^60) [2470]. При насыщающих концентрациях
iNAD+ кажущаяся константа равновесия перехода между состояниями R и Т
(L') зависит от относительного сродства NAD+ к этим двум состояниям
(которое характеризуется константами диссоциации Кк и Кт), от числа
связывающих центров (в данном случае четыре центра) и от величины
аллостерической константы L следующим образом:
<8-405>
Величина U рассчитана с использованием значений этих констант, полученных
при изучении кинетики релаксации [2470], и составляет 1,5-10-4, т. е.
полностью насыщенный фермент находится преимущественно в R-состоянии.
Поскольку NAD+ может связываться с ферментом как в R-, так и в Т-
состоянии и переход между этими формами
R
jr
RNAD
: TNAD
Рис. 8.57. Модель, предложенная Киршнером и др. [2469'-2470] для
объяснения кооперативных свойств глицеральдегидфосфатдегидро-геназы из
дрожжей.
R(NAD)2 Т--........." T(NAD),
\\ и
R(NAD), ,------------- T(NAD)3
R(NAD)4
T(NAD),
650
Глава 8
Время, с
Рис. 8.58. Результаты, полученные методом остановленной струи, для
глицеральдегидфосфатдегидро-геназы из дрожжей (по [2469]). Кривая /
получена при быстром смешивании с раствором глице-ральдегид-3-фосфата
см^си фермента и NAD+. Кривая Я -при быстром смешивании раствора фермента
и смеси глицеральдегид-3-фосфата и NAD+.
является относительно медленным, преобладание Т-состояния в отсутствие
NAD+ означает, что добавленный NAD+ будет связываться преимущественно с
этим состоянием, а затем будет происходить переход в R-состояние. Киршнер
[2469], используя этот вывод, попытался выяснить, различаются ли два
указанных состояния фермента по каталитической активности. Результаты
эксперимента, полученные методом остановленной струи, представлены на
рис. 8.58. Когда смесь фермента и избытка NAD+ быстро смешивали с
раствором глицеральдегид-3-фосфата, ферментативная реакция протекала без
заметного лаг-периода (кривая /). В этих условиях при смешивании с
глицеральдегид-3-фосфатом фермент находился практически полностью в форме
R(NAD+)4. Однако, когда фермент быстро смешивали со смесью NAD+ и
глицеральдегид-3-фосфата (кривая //), кинетическая кривая накопления
продукта имела четко выраженный лаг-период. Этот лаг-период обусловлен
медленным конформа-ционным переходом из Т- в R-состояние, происходящим
