Ферменты 2 - Диксон М.
Скачать (прямая ссылка):
и функции этих ферментов, целесообразно рассматривать их как отдельный
класс. В зависимости от природы переносимой группы X трансферазы
разделены на ряд подклассов; вторая цифра в кодовом номере фермента
указывает на характер этой группы: например, ферменты, переносящие
фосфат, имеют кодовые номера 2.7.-.-. При рассмотрении механизма действия
той или иной трансферазы прежде всего необходимо ответить на два вопроса,
(а) Какая часть молекулы субстрата АХ представляет собой переносимую
группу X, другими словами, какая именно связь разрывается в процессе
реакции? Этот вопрос относится также к тем гидролизам класса 3, которые
способны катализировать реакции переноса. (б) Как осуществляется перенос
- в одну стадию путем прямого переноса X от А к В или же в результате
двухстадийного процесса. В последнем случае сначала X переносится на
фермент с образованием соединения ЕХ и освобождением А, а затем в ходе
самостоятельной второй стадии происходит перенос X от фермента на В.
ИДЕНТИФИКАЦИЯ СВЯЗИ, расщепляемой в ходе реакции
Мы рассмотрим этот вопрос как для трансфераз, так и для гидролаз. При
исследовании реакций, в которых имеет место расщепление молекул субстрата
на две части, не всегда легко определить, где именно произошло
расщепление. Две части молекулы обычно соединены связующим атомом, чаще
всего - атомом кислорода, и расщепление может происходить либо по одну,
либо по другую сторону от этого атома. Например, при гидролизе сахарозы
разрыв может произойти между связующим атомом О и глюкозной частью
молекулы (в этом случае кислород должен остаться в составе свободной
молекулы фруктозы) или может быть расщеплена связь между кислородом и
фруктозной частью молекулы. При гидролизе фосфорных эфиров может
расщепляться либо связь С-О, либо связь Р-О. Вопрос о том, какая именно
связь расщепляется, очень важен для установления механизма действия
ферментов, особенно в сочетании с данными об оптических инверсиях (см.
ниже) j
Этот вопрос изучали изотопными методами с применением 180 (особенно много
работала в данной области М. Кон ;[829]). Наиболее прямой подход состоит
в том, чтобы синтезировать
426
Глава 7
субстрат, у которого место связующего атома занимает 180, и затем
определить, какая часть молекулы содержит 180 после реакции. Однако такой
синтез может представлять известные трудности; поэтому используют также и
два других, значительно более простых метода.
Первый метод основан на следующем. Если гидролиз немеченого субстрата
проводится в Н2180, то ясно, что в зависимости от места расщепления 180
будет обнаружен либо в одной, либо в другой части молекулы. Рассмотрим
гидролиз молекулы А-О-X. Очевидно, здесь возможен разрыв в одном из двух
положений:
о*н
-X
НО'
(7.21)
В первом случае 180 будет присутствовать в АОН, во втором - в ХОН. Этот
метод использовали Полани и Забо ([3707} при изучении щелочного гидролиза
сложного эфира. (Для удобства изотопные атомы отмечены звездочкой.)
Во втором методе используется обычная вода, а к раствору, содержащему
фермент, добавляют АОН и Х18ОН. При этом во время обратной реакции (т. е.
реакции синтеза), которая всегда в известной степени катализируется
ферментом, образуется - в зависимости от места расщепления - либо меченый
(А-180- -X), либо немеченый (А-О-X) продукт:
а4-о-н н-о"-х
А-О-4-Н Н-О'-гХ
I
A-O'-X
I
А-О-Н Н-O'-X
1
А-О-X 1
А-О-Н Н- О -X
(7.22)
В результате ферментативного гидролиза (на схеме - вторая стадия) в
первом случае будет образовываться Х18ОН, как и в исходном состоянии, а
во втором - немеченый ХОН (поскольку реакция протекает в обычной воде).
Следовательно, если время позволит реакции пройти в прямом и обратном
направлениях достаточное число раз, то во втором случае Х18ОН потеряет
практически весь свой 180, тогда как в первом случае не будет наблюдаться
потери 180. В исследованиях, в которых был применен этот метод, роль ХОН
играла ортофосфорная кислота НзР18С>4, в молекуле которой все атомы
кислорода были мечеными. В ходе каждой отдельной реакции удалялось не
более одного атома 180, но так как все ОН-группы Н3Р1804 принимали
участие в реакции с равной вероятностью, то при достаточном числе
оборотов удалялись все атомы 180.
Этот метод можно использовать также при изучении реакций переноса,
например при изучении действия фосфорилаз; в этом
Механизм действия ферментов
427
Таблица 7.4
Связи, расщепляемые при ферментативном и неферментативном гидролизе
Катализатор Расщепляемая связь (указана стрелкой) Субстрат
Кислота 1 С-О-Р * С-О-Р С-О-Р С-О-Р * с-О-Р С-О-Р 1 Глюкозо-1-фосфат
Кислота Триметилфосфат
Щелочь Г лицеральдегидфосфат дегидрогеназа (КФ 1.2.1.12)
Триметилфосфат Ацетилфосфат
Гликогенфосфорилаза (КФ 2.4.1.1) Г ликоген+Фосфат
Сахарозофосфорилаза (КФ 2.4.1.7) Г люкозо-1 -фосфат+Фосфат
РибонуклеазаГ (КФ 3.1.4.22) с-о-Р I Полинуклеотид
Щелочная фосфатаза (КФ 3.1.3.1) С-О-Р I Г люкозо-1 -фосфат
Щелочная фосфатаза (КФ 3.1.3.1) С-О-Р 1 Фенилфосфат
