Ферменты 2 - Диксон М.
Скачать (прямая ссылка):
ситуация наблюдалась в случае глицераль-дегидфосфатдегидрогеназы из
сердечной мышцы кролика [191]. Кроме того, необходимо показать, что в
присутствии данной соли или денатурирующего агента происходит полная
диссоциация белка. Например, исследования размера субъединиц аспартат-
карбамоилтрансферазы, выполненные методом седиментации, дали неправильные
результаты, поскольку диссоциация фермента, которую проводили с помощью
солей ртути [1526], была неполной [5014].
Особенно простым методом определения молекулярной массы субъединиц,
получившим широкое распространение, является электрофорез в
полиакриламидном геле с додецилсульфатом натрия [1173, 5015]. Показано,
что если предварительно разрушить все имеющиеся в молекуле дисульфидные
связи, то подвижность белка в среде, содержащей додецилсульфат натрия,
будет пропорциональна молекулярной массе субъединиц.
Чтобы предотвратить диссоциацию фермента при обработке его
додецилсульфатом натрия, для ковалентного поперечного сшивания субъединиц
можно использовать бифункциональные агенты, способные реагировать с
боковыми цепями аминокислот в белке (ем. обзоры [4724, 5131]). В этих
условиях можно определить молекулярную массу агрегированной формы
фермента [993]. Преимущество этого метода состоит в том, что
Структура ферментов
771
поперечное сшивание может быть проведено при относительна низких
концентрациях фермента, так что состояние агрегации будет аналогично
таковому в опытах по определению активности фермента.
В арсенале методов, используемых для определения числа субъединиц в
ферменте [2121, 5014], важное место занимают методы белковой химии,
такие, как определение N-концевых аминокислот [5014] и анализ
триптических гидролизатов методом отпечатков пальцев, хотя метод
сопоставления числа пептидов, образующихся при гидролизе трипсином, с
общим содержанием суммы аргинина и лизина в белке может привести к
ошибочным результатам в тех случаях, когда "ядро" молекулы белка
устойчиво к действию протеиназы.
Из табл. 10.2 можно видеть, что лишь небольшое число полимерных ферментов
образовано нечетным числом субъединиц. Было высказано предположение, что
симметрия, которая обусловлена присутствием в ферменте четного числа
идентичных субъединиц, может создавать определенные селективные
преимущества, и Шанжё [736, 3217], формулируя одну из теорий аллостерии,
учитывал наличие в молекуле фермента оси симметрии; наличие оси симметрии
предусматривается также в теории межаллельной комплементации [920].
Однако рентгеноструктурные исследования кристаллов димера гормона
инсулина показали, что идентичные субъединицы этого белка расположены
несимметрично [116, 472, 4477].
Можно утверждать, что для белков, состоящих из идентичных субъединиц,
взаимоузнавание участков взаимодействия двух субъединиц имеет важное
селективное значение. Так, если имеется более чем один ген, кодирующий
данную полипеп-тидную цепь, то какая-либо мутация в .одном гене,
приводящая к неправильной укладке полипептидной цепи, повлечет за собой
изменение узнаваемого участка субъединицы, он не будет узнан и,
следовательно, не будет участвовать в образовании олигомера. Тогда для
таких случаев, когда только олигомерная форма обладает значительной
активностью, у диплоидных организмов такие мутации не проявятся. Более
важное преимущество субъединичной структуры выявляется в процессе
межаллельной комплементации (гл. 12). Этот термин характеризует ситуацию,
в которой одна вредная мутация может компенсироваться другой мутацией,
причем обе эти мутации присутствуют в паре аллельных генов. Высказано
предположение, что такая комплементация с образованием олигомерного белка
возможна тогда, когда объединяются пары субъединиц с разными мутациями
[709, 920, 1337]. Полагают, что комплементация происходит вследствие
того, что неправильное свертывание данной молекулы, вызываемое мутацией,
компенсируется при взаимодействии ее с другой молекулой, адекватно
772
Глава 10
уложенной в области взаимодействия. Очевидно, что компенсация не может
быть полной и комплементированный фермент будет отличаться от нативной
формы такими свойствами, как термостабильность, энергия активации и
величина Км (см. [709]).
Ряд случаев комплементации был исследован in vitro. Финчем детально
изучил две дефектные мутантные формы глута-матдегидрогеназы из Neurospora
[808, 1338] и показал, что они могут быть разделены хроматографически и
комплементация имеет место только у гибридных олигомерных форм, которые
содержат оба типа мутантных субъединиц.
Субъединичная структура, по-видимому, является характерной чертой
большинства ферментов. Так, Кэтчсайд [709] показал, что более половины
генов, исследованных у Neurospora crassa, способны к межаллельным
взаимодействиям (комплементации). Эти результаты свидетельствуют о том,
что более половины генов в этом организме кодируют образование белков,
которые состоят из субъединиц. Из табл. 10.2 видно, что субъединичная
