Научная литература
booksshare.net -> Добавить материал -> Медицина -> Зайцев С.В. -> "Наркомания. Нейропептид Морфиновые рецепторы " -> 50

Наркомания. Нейропептид Морфиновые рецепторы - Зайцев С.В.

Зайцев С.В., Ярыгин К.Н., Варфоломеев С.Д. Наркомания. Нейропептид Морфиновые рецепторы — МГУ, 1993. — 256 c.
ISBN 5-211-02349-8
Скачать (прямая ссылка): narkomaniya1993.djvu
Предыдущая << 1 .. 44 45 46 47 48 49 < 50 > 51 52 53 54 55 56 .. 108 >> Следующая

Однако при столь многочисленных достоинствах радиорецеп-торный анализ долгое время имел в качестве существенного недостатка низкую стабильность мембранных препаратов рецепторов. Следствием этого являлись необходимость постоянного выделения мембранных препаратов и связанная как с различными выделениями, так и с низкой стабильностью каждого отдельно выделенного препарата нестандартность мембран. В последнее время проблема стабильности и стандартности мембранных пре паратов была успешно решена. Авторами настоящей работы получены лиофилизованные мембранные препараты, обладающие крайне высокой стабильностью даже при комнатной температуре. (Зайцев с соавт., 1984; Сергеева с соавт., 1986).
Помимо стабильности рецепторов важным моментом в радио-рецеиторном анализе пептидов является проблема стабильности меченого и исследуемого лигандов, поскольку препараты мембран, как правило, содержат целый набор протеолитических ферментов. Эту проблему обычно решают путем добавления.в среду анализа ингибиторов пептидаз (Miller et al., 1977; Altstein et al., 1983), работой при пониженных температурах (Gillan et al., 1985; Summers, Hayes, 1980) и использованием стабильных меченых лигандов (например, аналогов содержащих D-аминокислоты или эфирные и амидные группы на С-конце) (Kosterlitz, 1980; Tremean et al., 1981; Paterson et al., 1984).
Необходимо отметить, что радиорецепторный метод анализа “чувствует” все те соединения, которые высокоэффективно взаимодействуют с рецепторами.
Поэтому, если в анализируемом образце содержится несколько соединений, способных высокоспецифично связываться с рецепторами, то метод дает их эффективную суммарную концентрацию. Полученная концентрация в общем случае не является суммой концентраций данного класса соединений в образце, поскольку эти соединения, несомненно, как-то различаются по сродству к рецепторам и зависят от вида лиганда, использованного для построения калибровочной кривой, в чьих эквивалентах она и выражается. Определение общей эффективной концентрации соединений данного вида в ряде случаев является не недостатком, а даже достоинством радиорецепторного метода, поскольку позволяет получать ценную информацию об общей активности в образце данного класса соединений по отношению к специфическим к ним рецепторам.
В основе количественного определения соединений радиоре-цепторным методом лежит конкурентное ингибирование связывания меченого лиганда со специфическими к нему рецепторами. Полученные в ходе анализа оезультаты измерения радиоактивности связанной с мембранами метки сравнивают со стандартной (калибровочной) кривой (рис. 5.1) и по ней определяют концентрацию исследуемого лиганда. В простейшем случае, когда меченый и исследуемый лиганды специфически связываются только с одним рецептором R:
мин
Рис. 5.1. Калибровочная кривая для определения концентрации Tyr-D-Ala-Gly-Phe-Leu-Arg по вытеснению 3Н-налоксона (0,4 нМ) в среде, содержащей 10 мМ HEPES; pH 7,4; 25°С
L* + R^L*R, L + R^LR, (5.1)
концентрация связанного с мембранами меченого соединения В* задается соотношением
[B.j = — --------------+ к.ль.]_ (5/i)
к- (l + И) + [L*
где [R]o - общая концентрация данного рецептора, К*, К - константы диссоциации комплексов (L*R) и (LR) соответственно, К*с - константа, характеризующая процесс неспецифического связывания лиганда с мембранами, [L*], [L] - концентрации меченого и анализируемого соединений в растворе. В условиях проведения ра-диорецепторного анализа концентрации связанных лигандов, как правило, значительно меньше их концентраций в растворе, поэтому вместо [L*] и [L] можно использовать значения исходных концентраций лигандов. Из уравнения (5.2) следует, что концентрация связанной с мембранами метки гиперболически уменьшается при увеличении концентрации анализируемого соединения. Фактически это уравнение является математическим обоснованием радиорецепторного метода анализа в случае простейшей схемы (рис. 5.1).
Ключевыми характеристиками любого метода анализа, в том числе и радиорецепторного, являются его чувствительность и точность. Поэтому представляется целесообразным остановиться на рассмотрении этих характеристик более подробно.
Чувствительность радиорецепторного анализа. Чувствительность радиорецепторного анализа можно определить как минимальную, доступную измерению с помощью данной кривой концентрацию лиганда [L]m;n (рис. 5.2). Следовательно, [L]min -наименьшая концентрация лиганда, при которой отличие уровня связывания меченого лиганда с мембранами [B*]i и уровня его связывания в отсутствие немеченого лиганда [В*]о еще статистически значимо. Под статистической значимостью в данном случае понимается, что в предположении, что ошибки измерения величин [В*]о и [B*]i нормально распределены и оценки стандартных отклонений Si_hx средних значений [В*]о и [B*]i одинаковы, средние значения [В*] и [B*]i различаются по критерию Стью-
Предыдущая << 1 .. 44 45 46 47 48 49 < 50 > 51 52 53 54 55 56 .. 108 >> Следующая

Реклама

c1c0fc952cf0704ad12d6af2ad3bf47e03017fed

Есть, чем поделиться? Отправьте
материал
нам
Авторские права © 2009 BooksShare.
Все права защищены.
Rambler's Top100

c1c0fc952cf0704ad12d6af2ad3bf47e03017fed