Наркомания. Нейропептид Морфиновые рецепторы - Зайцев С.В.
ISBN 5-211-02349-8
Скачать (прямая ссылка):
Поскольку опиоидные рецепторы - мембранные рецепторы,. не исключена возможность, что эффекты ионов металлов и водорода связаны не с прямым их взаимодействием с рецепторным комплексом, а с их влиянием на состояние липидной мембраны. Действительно, взаимодействие катионов с кислыми головками фосфолипидов приводит к экранированию ими зарядов мембранных липидов (Duzgures et al., 1984), что в свою очередь изменяет жидкостность липидного биослоя мембраны, температуру ее фазового перехода и может косвенно повлиять на рецепцию опиатных лигандов. Для проверки этого предположения было изучено влияние pH и присутствия в среде двухвалентных ионов на температурную зависимость связывания 3Н-Г)-А1а2, 0-Ьеи5-энкефалина с мембранным препаратом головного мозга крыс, соответствующие результаты представлены на рис. 4.9. Из данных, приведенных на рис. 4.9, видно, что добавление ионов Са2+ и Мп2+, как и варьирование pH среды, не приводит к изменению формы кривой температурной зависимости связывания лиганда с высоко- и низкоаффинными рецепторами. Во всех случаях резкое снижение уровня связывания наблюдается при температурах выше 32°. Полученные результаты позволяют сделать вывод, что катионная регуляция как высоко-, так и низкоаффишюй рецепции D-Ala2, Б-Ьеи5-энкефалина не связана с изменением состояния мембранного окружения рецептора (жидкостное I ьк > м мбраны), а опосредуется комплексооб-разованием иона с ка i ионсвязывающим регуляторным участком pi'Ut н го ра.
Рис. 4.8. Проверка обратимости влияния изменений pH на значение константы диссоциации комплекса 3H-D-Ala~, D-Leu5-a нкефалина с /j-рецептора-ми (Кзнабл): 1 - преинкубация в течение 30 мин при pH 7,4, К3на5л определяли при различных pH среды инкубации; 2 - преинкубация в течение 30 мин при различных pH среды преинкубации, Кзнабл определяли при pH 7,4; 3 - без преинкубации, Кзнабл определяли при различных pH среды инкубации; буфер Г, 37°С
Рис. 4.9. Зависимость уровней связывания 3H-D-Ala2, D-Leu^-энквфалина с высокоаффинным (Л - концентрация лиганда 1 нМ) и низкоаффинным (Б - концентрация лиганда 110 нМ) центрами: I - pH 7.4; 2 - pH
6,8; 3 - pH 7,8; 4 ~ то же, что и (/) + 5 мМ СаС12; 5 - то же, что и (i)+l мМ МпС12, буфер Г, 37°С
IV.2.1. Механизм влияния ионов металлов на процесс комплексообразования 3H-D-Ala2, Б-Ьеи5-энкефалина с /i-рецепторами
С целью более подробного выяснения механизма катионной активации связывания D-Ala2, Б-Ьеи5-энкефалина с рецепторами было исследовано влияние концентрации ионов водорода в диапазоне pH б,2-8,3 на связывание лиганда в отсутствие и при наличии ионов металлов (Зайцев с соавт., 1985в; Зайцев с соавт., 1987). Соответствующие результаты представлены на рис. 4.14 (см. ниже). Они говорят о том, что при повышении pH в слабощелочной области наблюдается значительное увеличение ^КзНабл- Анализ экспериментальных данных (рис. 4.10, кривая 1) с использованием ЭВМ показывает, что процесс низкоаффинного связывания контролируется ионогенной группой с рКа 7,9. Поскольку группы с такими значениями рКа могут присутствовать как в лиганде, так и в рецепторе, необходимо было выяснить, к какому из участвующих в связывании компонентов они относятся. Для ответа на этот вопрос было проведено титрование D-Ala2, ОДеи5-энке-фалина в диапазоне pH 6,0-8,5. Титрование показало, чю рКа ионогенной группы D-Ala', 0-Ьеи5-энкефалина (по всей видимости. N-концевого тирозина) равно 7,9. Все это позволяв] предположить, что увеличение К;;набЛ при переходе к слабощелочной среде обусловлено депротонированностью N-концевой группы молекулы D-Ala2, О-Ьеи'^нкефалина.
Добавление ионов Са" + даже в относительно высоких концен-!|>;,Ш1ях (о мМ) не влияет на pH-зависимость связывания D-Ala2,
Б-Ьеи5-энкефалина с /z-рецепторами. Присутствие ионов Мп2+ в концентрации 2 мМ приводит к сильному смещению рН-зависи-мости в сторону более низких значений констант диссоциации. Для выяснения возможности конкуренции ионов водорода и металла за катионсвязывающий участок /z-рецептора было изучено влияние pH на константу диссоциации комплекса металла с низкоаффинным центром К^ез. С этой целью для исследования был выбран ион Ni2+, активирующий только низкоаффинный центр связывания D-Ala2, 0-Ьеи5-энкефалина. Результаты проведенного исследования, представленные на рис. 4.11, говорят о том, что зависимость константы К|^з от [Н+] линейна. Отсюда следует, что ионы водорода и металла взаимно конкурируют с катионсвя-зывающим участком низкоаффинного центра связывания D-Ala2, 0-Ъеи5-энкефалина.
Проведенный комплекс исследований и полученные результаты позволяют предположить следующую схему, характеризующую влияние ионов на связывание 3H-D-Ala2, 0-Ъеи5-энкефалина с низкоаффинным центром в диапазоне pH 6,2-8,3:
RH+ + LH
+ »/к„
н+ L
Н\Кь R + LH
н\Кь RMe + LH
«К,
