Наркомания. Нейропептид Морфиновые рецепторы - Зайцев С.В.
ISBN 5-211-02349-8
Скачать (прямая ссылка):
ствии существенных диффузионных затруднений при взаимодействии лигандов с рецепторами. Изучение кинетики связывания лигандов показывает, что равновесие в системе устанавливается уже через 10-15 мин и уровень равновесного связывания не меняется в течение по меньшей мере двух часов. Это говорит о сохранении активности опиоидных рецепторов в указанном промежутке времени и позволяет выбрать оптимальный временной диапазон изучения равновесного связывания опиатных лигандов.
При изучении взаимодействия лигандов с центрами связывания важным моментом является проверка обратимости процесса связывания (Зайцев, 1987). Результаты проведенных исследований (например, рис. 3.2) показывают, что связывание опиатных лигандов с мембранными препаратами обратимо. Следовательно, процесс комплексо-образования опиатов и опиоидных пептидов с рецепторами может быть описан схемой (2.1). Принципиальным вопросом биохимического и физико-химического исследования взаимодействия опиатных лигандов с рецепторами является определение количества различных типов опиоидных рецепторов, с которыми связывается тот или иной лиганд, а также их характеристик. С целью выяснения числа и характеристик различных типов опиоидных рецепторов были изучены изотермы связывания опиата 3Н-морфина, опиоидного пептида 3Н-D-Ala2, В-Ьеи5-энке-фалина с рецепторами мембранных препаратов головного мозга крыс (Зайцев и др., 1985; Зайцев, 1987; Varfolomeev, Zaitsev et al.,
1987). Анализ экспериментальных данных проводился с испс _>-зованием разработанных в настоящей работе МИМ и разностного метода (рис. 3.3, 3.4). Полученные результаты с учетом установленного ниже (см. III.2.2) факта отсутствия кооперативных взаимодействий в системе позволяют сделать вывод о том, что опиат морфин и опиоидный пептид D-Ala2, В-Ьеи5-энкефалин взаимодействуют по крайней мере с тремя независимыми центрами связывания мембранного препарата головного мозга крыс. Параметры комплексообразования морфина и D-Ala2, D-Leu°-3H-кефалина с этими центрами приведены в табл. 3.3.
М у [В], ’
Рис. 3.2. Обратимость специфического свя-' зываиия 1,1 нМ Зн -морфина 1 нМ 3Н-налоксо-на с мембранным препаратом (в % от уровня связывания в условиях равновесия).
Стрелкой указан момент добавления 1000 нМ немеченого лиганда. Буфер А, 37°С
Рис. 3.3. А. Анализ изотермы связывания 3Н-морфина с мембранным препаратом в координатах разностного метода [Lct]=3,9 нМ.
Б. Специфическое связывание 3Н-морфина в координатах Скэтчарда с учетом вычитания вклада супервысокоаффинного центра. Буфер А, 37°С
Рис. 3.4. А. Анализ изотермы связывания 3H-D-Ala2, 0-Ьеи5-энкефалина с мембранным препаратом в координатах разностного метода ([Lct]=1>4 нМ). Б. Специфическое связывание 3H-D-Ala2, D-Ьеи^-энкефалина в координатах Скэтчарда с учетом вычитания вклада супервысокоаффинного центра. Буфер А, 37°С
Таблица 3.3 Параметры связывания лигандов с пр епаратом мембран головного мозга
¦ (I - буфер А, II - буфер А с заменой 120 мМ NaCl на 120 мМ КС1, 37° С)
Лиганд
Центр Параметр Морфин D-Ala'* D-Leu&-
связывания энке фалин
I II I II
Супервысо К, нМ 0,6 0,1 0,5 0,4
коаффинный Гр1 пмо ЛЬ 0,006 0,006 0,005 0,005
‘ ¦'0’ мг белка
Высоко К, нМ 11,5 2 6,5 3,5
аффинный [R]0, ПТЛ" 0,11 0,09 0,10 0,10
1 JU мг белка
Низко К, нМ 120 100 40 50
аффинный [R]0, ПТЛЬ 0,12 0,10 0,12 0,12
1 JU мг белка
Итак, изотерма комплексообразования как морфина, так и D-А1а2, 0-Ьеи5-энкефалина соответствует связыванию этих лигандов не с двумя, а с тремя независимыми типами центров комплексообразования. Отметим, что один из центров связывания каждого лиганда характеризуется исключительно высоким сродством (су-первысокоаффинный центр) и чрезвычайно низкой концентрацией, в отличие от широко описанных в литературе (Chang et al., 1981; Doctal, 1982; Schiller, DiMaio, 1982; Cotton et al., 1985) высокоаффинных и низкоаффинных центров связывания этих лигандов. Заметим, что существование трех независимых типов центров связывания морфина и D-Ala2, В-Ьеи5-энкефалина показано нами (табл.
3.3) и для среды Б (буфер А, в котором ионы натрия заменены на К+). Следовательно, супервысокоаффинный центр связывания проявляется и в отсутствие одного из регуляторов опиатной рецепции ионов Na+.
Как установлено нами выше, существование супервысокоаф-финного центра связывания характерно не только для изотерм комплексообразования опиата морфина, но также и для изотерм связывания опиоидного центра пептида D-Ala2, В-Ьеи5-энкефали-на (табл. 3.3). Возникает вопрос: как соотносятся эти центры? Существует ли один общий центр к которому опиаты и опи-
