Инфекционные болезни национальное руководство - Венгеров Ю.Я.
ISBN 978-5-9704-1000-4
Скачать (прямая ссылка):
Иммунохроматографичоскнй мотод
Иммунохроматографический анализ — экспресс-метод определения веществ (антигена, антител) в биологических материалах (моча, цельная кровь, сыворотка
Рис. 5-19. Иммунный блоттинг (определение антител к антигенным детерминантам вируса иммунодефицита человека).
ЛАБОРАТОРНЫЕ МЕТОДЫ ДИАГНОСТИКИ 85
или плазма крови, слюна и др.). Проведение иммунохроматографического анализа не требует специального оборудования, тесты просты в употреблении, имеют широкий диапазон температуры хранения (от 2 до 30 °С). Чувствительность и специфичность тестов достигают 98,8-99,8 и 99,7-100% соответственно.
Анализ материала осуществляют с помощью индикаторных полосок, палочек, панелей, тест-кассет, обеспечивающих быстрое проведение теста. Результат учитывают через 20 мин.
Тест-полоска имеет две зоны: тест-зону и контрольную (рис. 5-20), в которых иммобилизированы антитела к исследуемому антигену или антителу.
В иммунохроматографических тестах используют три типа антител:
? моноклональные антитела к исследуемому антигену или антителу, конъюгированные («сшитые») с коллоидным золотом — красителем, который можно легко идентифицировать в самых малых концентрациях: эти антитела нанесены вблизи участка погружения тест-полоски в физиологическую жидкость (кровь, моча):
? поликлональные антитела к исследуемому антигену или антителу, иммобилизованные в тест-зоне полоски;
Исследуемый антиген
Конъюгат специфичного к исследуемому антигену антитела с красителем, мигрирующим вдоль полоски, вместе с физиологической жидкостью
Антитело, специфичное к исследуемому антигену, иммобилизированное на тест-полоске
Y Вторичное антитело, специфичное к антителам с красителем, иммобилизированное на тест-полоске
Рис. 5-20. Схема проведения иммунохроматографического анализа (определение антигена в клиническом материале): Т — тест-зона, К — контрольная зона; А — положительный результат — появление двух тёмных полос в тест-зоне и контрольной зоне; Б — отрицательный результат — появление одной тёмной полосы в контрольной зоне.
86 МЕТОДЫ ДИАГНОСТИКИ
? вторичные (антивидовые) антитела к моноклональным антителам, иммобилизованные в контрольной зоне тест-полоски.
Принцип иммунохроматографического теста: физиологическая жидкость при погружении тест-полоски мигрирует вдоль неё по принципу тонкослойной хроматографии вместе с антителами типа 1 (конъюгат). При наличии в клиническом материале исследуемого антигена (инфекционный или онкологический маркёр, гормон) происходит его связывание с антителами как типа 1, так и типа 2, фиксированными в тест-зоне полоски. При этом появляется тёмная полоса. Несвязавшийся конъюгат (антитела типа 1) мигрирует далее вдоль полоски и взаимодействует с вторичными антителами (антитела типа 3) в контрольной зоне, где появляется вторая тёмная полоса. Тёмная полоса в контрольной зоне должна проявляться всегда, независимо от присутствия исследуемого антигена в физиологической жидкости (внутренний контроль прохождения реакции). Результаты учитывают визуально или путём компьютерной обработкой сканированного изображения.
Молекулярно-генетические методы
Молекулярно-генетические методы основаны на обнаружении в исследуемом материале родо- или видоспецифических последовательностей дезоксирибонуклеиновой кислоты (ДНК) или рибонуклеиновой кислоты (РНК) микроорганизма, выявление которых позволяет определить наличие возбудителя в материале от больного.
Двойная спираль ДНК построена из дискретных нитей, соединённых водородными связями между комплементарными основаниями («аденин-тимин», «гуанин-цитозин»). Эти связи непрочные, поэтому in vitro двухцепочечная ДНК может быть разделена на отдельные нити нагреванием до 95-100 °С, а при понижении температуры в результате случайных молекулярных взаимодействий комплементарные цепи реассоциируют с образованием двухспиральной молекулы. Этот процесс реассоциации одноцепочечной ДНК с образованием двухспиральной молекулы называется гибридизацией. Гибридизация возможна в системе «ДНК-РНК», «РНК-РНК»; она происходит только между комплементарными нуклеотидными последовательностями. Принцип комплементарное™ лежит в основе молекулярно-генетических методов диагностики инфекционных болезней.
Полнморазная ценная реакция
Принцип метода ПЦР состоит в многократном увеличении числа копий специфического участка ДНК возбудителя, катализируемом in vitro термостабильной ДНК-полимеразой в автоматическом режиме. Этот процесс называют направленной амплификацией ДНК. В результате амплификации количество копий специфической нуклеотидной последовательности в реакционной пробе возрастает в 106-108 раз, что обеспечивает высокую чувствительность метода. Применение методов детекции продуктов амплификации (ампликонов) позволяет констатировать наличие возбудителя в исследуемой пробе.
ПЦР имеет три технологические стадии:
? выделение и экстракция ДНК (пробоподготовка);
? амплификация;
? регистрация результатов амплификации.
