Антифосфолипидный синдром - Насонов Е.Л.
ISBN 5-98216-010-5
Скачать (прямая ссылка):
Интенсивно изучалась возможность использования в тест-системах для иммуноферментного анализа аФЛ, помимо КЛ, других ФЛ, включая ФИ, ФС, ФЭ, ФХ и различные смеси ФЛ19. Полагают, что обнаружение
SHS-OOO4.qxd 21.11.2006 16:56 Page
16
Насонов Е.Л. Антифосфолипидный синдром.
различных субтипов аФЛ при АФС в основном определяется степенью их связывания с ?2-m-I и не зависит от специфического взаимодействия с отдельными ФЛ, за исключением реагирования антител с ФЭ20. E.N. Harris и S.S. Pierangeli21 предложили определять антитела к смеси ФЛ с помощью разработанной ими тест-системы "APhL ELISA kit" для диагностики "сомнительного" АФС у больных с отрицательными результатами тестирования аКЛ и ВА или с низкими титрами аКЛ. В то же время чувствительность и специфичность данного метода не нашла подтверждения в работе H.M. Day и соавт.22.
Блокирование участков неспецифического связывания обычно проводится с помощью 10% раствора фетальной телячьей или бычьей сыворотки в фосфатно-солевом буфере в качестве источника кофактора ?2-ГП-I, который связывается с иммобилизированным на твердой фазе КЛ и частично — со свободными участками на поверхности микроплат. Следует подчеркнуть, что любые методические различия, касающиеся концентрации бычьей сыворотки, разведения и объема проб в лунке, свойств КЛ (окисление, степень очистки) могут приводить к изменению связывающей активности ?^Hl-I и результатов определения аКЛ. При измерении соотношения ?2-ГП-I-зависимых и ?2-ГП-I-независи-мых субфракций аКЛ до и после внесения в тест-систему экзогенного ?^ni-I используется буферный раствор с добавлением бычьего сывороточного альбумина или желатина23. Тестируемые сыворотки разводятся блокирующим буферным раствором, содержащим не только ?2-ГП-I, но и другие белки сыворотки быка. Кроме того, в образцах исследуемых сывороток может присутствовать и собственный ?^Hl-I человека. В связи с этим при определении аКЛ в сыворотке крови рекомендуется вычитать ОП лунки без КЛ из ОП лунки с КЛ. При определении аКЛ с помощью ИФМ не рекомендуется предварительное прогревание сывороток, приводящее к конвертации аКЛ-отрицательных образцов в аКЛ-положительные, в том числе и у здоровых лиц24, 25. Несмотря на предположение, согласно которому использование в тест-системе для иммуноферментного анализа аКЛ 0,05% буферного раствора детергента Tween 20 позволяет отличить ?2-ГП-I-зависимые от ?2-ГП-I-незави-симых аКЛ26, имеются данные, что Tween 20 может полностью блокиро-
SHS-OOO4.qxd 21.11.2006 16:56 Page
ГЛАВА 8. Клиническое значение антифосфолипидных антител
вать связывание ?2-ГП-I с КЛ27, а также удалять КЛ со дна лунок при отмывках28.
Одной из наиболее сложных проблем лабораторной диагностики АФС является недостаточно высокая специфичность аКЛ, что в ряде случаев может приводить к ложноположительной диагностике АФС. Улучшение диагностики АФС связано с необходимостью определения а?2-ГП-I, обладающих большей специфичностью в отношении диагноза АФС.
При внесении очищенных антител больных в тест-систему для им-муноферментного анализа аКЛ без добавления фетальной сыворотки было показано, что ?^^I является кофактором, обязательным для специфического связывания "аутоиммунных" аКЛ, ассоциирующихся с АФС, подавляя связывающую активность "инфекционных" аКЛ29, 30. Содержание ?^T^I в иммуноферментном тесте, соответствующее оптимальному связыванию аКЛ, составляет 8 мкг/мл и более; при концентрации ?^Hl-I менее 1 мкг/мл связывающая активность аКЛ падает до нуля31. В сыворотке человека ?^^I присутствует в концентрации около 200 мкг/мл, в то время как в бычьей сыворотке его уровень в 2—3 раза выше32. Большинство, но не все субтипы аКЛ человека связываются с бычьим ?2-ГП-I33, 34. Количеству аКЛ в тестируемой сыворотке, разведенной 1:100 в 10% растворе феталь-ной сыворотки, соответствует адекватный для оптимального связывания уровень ?^^I. Использование блокирующего и разводящего раствора без добавления фетальной сыворотки, содержащей экзогенный ?^Hl-I, приводит к значительному снижению связывающей активности аКЛ32.
Поскольку в препаратах бычьего кардиолипина и фетальной сыворотки, использующихся при определении аКЛ, содержится ?^Hl-I, полагают, что с помощью стандартного ИФМ можно выявлять как а?2-ГП-I, так и антитела, реагирующие собственно с кардиолипином. Другой подход к определению а?2-ГП-I основан на использовании иммобилизованного на твердой фазе аффинно-очищенного ?2-ni-I34-36. Поскольку а?2-ГП-I имеют низкую аффинность, для их выявления ИФМ необходима высокая плотность иммобилизации ?^Hl-I на твердой фазе36, кото-
SHS-OOO4.qxd 21.11.2006 16:56 Page
Насонов Е.Л. Антифосфолипидный синдром.
рая способствует экспрессии "скрытого" эпитопа в молекуле р2-ГП-Р4. Это достигается при использовании "высокосвязывающих" полистироловых микроплат, подвергнутых рентгеновскому облучению. Преимущество метода определения ар^ГП-I, по сравнению с определением аКЛ, до конца не ясно. Полагают, что первый обладает более высокой специфичностью, а второй — чувствительностью2. Действительно, стандартный метод определения аКЛ может давать "ложноположительные" результаты за счет выявления "непатогенных", реагирующих только с кар-диолипином антител, а частота обнаружения "патогенных" р2-ГП-Рзави-симых аКЛ может существенно варьировать в зависимости от содержания ?2-DI-I в тест-системе и эффективности его иммобилизации на твердой фазе. Однако определение ар2-ГПЛ также связано с определенными методическими проблемами. Во-первых, метод не стандартизован на международном уровне; во-вторых, на результаты может влиять ряд трудно поддающихся контролю факторов, в том числе способ выделения Р2-ГПЛ, его низкая стабильность, особенности иммобилизации, свойства твердой фазы и др.
