Радионуклидная диагностика для практических врачей - Лишманова Ю.Б.
ISBN 5-93629-166-9
Скачать (прямая ссылка):
Радиолигандный метод используется как для количественного, так и для качественного анализа. Если первоначально он находил применение только для определения некоторых природных полипептидных гормонов, то в настоящее время с помощью этого метода определяется весьма большое количество биологически активных соединений различной природы (гормоны, ферменты, маркеры миокардиального повреждения и др.).
Радиоиммунный анализ был впервые разработан Berson & Yalow (1960) для определения уровня эндогенного инсулина в плазме крови человека. Метод основан на конкуренции определяемого вещества со своим меченым аналогом за ограниченное число мест связывания у высокоспецифичных антител. В тест-системе радиоактивный лиганд связывается со специфическими антителами к немеченому лиганду, в результате чего образуется комплекс «меченый лиганд - антитело». Определяемый гормон (лиганд) плазмы крови конкурирует с меченым аналогом за связывающие места антитела и тем самым снижает взаимо-
действие последнего с меткой. Вследствие этого соотношение концентраций свободного и связанного с антителом лигандов уменьшается. Связанную и свободную формы меченого соединения разделяют одним из известных способов (адсорбция, фракционное осаждение, метод двойных антител и т.д.).
Заключительными этапами РИА являются радиометрия одной из фракций, построение калибровочной кривой, отражающей динамику изменений радиоактивности связанного (или свободного) лиган-да в зависимости от количества внесенного в пробирку немеченого аналога (стандарта). Концентрация гормона в анализируемом образце устанавливается путем сравнения радиоактивности этого образца с уровнем счета в стандартных пробах и перенесения полученного значения на калибровочную кривую.
К преимуществам РИА относятся: высокая чувствительность - способность выявлять минимальные количества вещества; специфичность -измерение количества только одного строго определенного вещества; точность - определение истинного количества вещества; воспроизводимость -возможность повторения результатов в одной пробе при анализе наборами из разных партий.
Недостатками РИА считаются: недолговечность хранения меченого лиганда по причине физического распада метки, ее отщепления и радиолиза носителя; разрушение лиганда при йодировании; необходимость высокой очистки лиганда; недостаточная чувствительность при низком содержании определяемого вещества в биологических жидкостях; низкая специфичность, обусловленная неселективным связыванием меченого соединения компонентами плазмы крови; необходимость предварительной экстракции определяемого лиганда в тех случаях, когда он связан с белками или липопротеидами плазмы, а также при наличии в крови веществ, обладающих перекрестной иммуно-реактивностью по отношению к определяемому лиганду.
Несмотря на все вышеперечисленные недостатки, РИА в настоящее время является самым распространенным методом радиолигандного анализа.
Иммунорадиометрический метод основан на использовании меченых высокоспецифичных антител. При ИРМА происходит разделение не свободного и связанного лиганда, а свободного и связанного антитела. При этом количество антител используется с избытком по отношению к лиганду. Обычно ход реакции следующий: в пробирку с определяемым гормоном вносят избыток меченых антител, инкубируют образец, после чего свободные антитела отделяют с помощью сефарозы, содержащей ковалентно связанный гормон, и удаляют центрифугированием. Радиоактивность полученного супернатанта прямо про-
2.1. Невизуализирующие радионуклидные исследования
27
порционально отражает содержание определяемого гормона.
ИРМА обладает рядом преимуществ по сравнению с РИА:
1) позволяет избежать влияния таких факторов, как неспецифическое связывание, поэтому является более точным и не требует предварительной экстракции проб;
2) разновидность ИРМА - метод двойного связывания - обладает более высокой чувствительностью за счет возможности проводить экстракцию определяемого вещества из относительно большого объема жидкости;
3) лиганд не йодируется, поэтому нет опасности его повреждения при обработке;
4) может быть использован для анализа веществ, с трудом поддающихся йодированию (например, циклические нуклеотиды, пептиды, лишенные ти-розиновых остатков);
5) меченые антитела менее подвержены радиолизу, чем меченые лиганды.
Наряду с преимуществами для ИРМА характерны следующие недостатки:
1) является довольно дорогостоящим, так как требует очистки высокоспецифичных антител и приготовления иммобилизованных антигенов или антител на сефарозе;
2) не годится для систем, в которых комплекс «антиген-антитело» обладает высокой константой диссоциации, поскольку добавление избытка иммобилизованных лигандов в конце периода инкубации может нарушить равновесие первичной реакции «антиген-антитело».
В связи с высокой стоимостью используемых реактивов иммунорадиометрический метод не получил широкого распространения.
Конкурентное белковое связывание является методом, основанным на использовании вместо антител естественных белков плазмы или тканей, которые обладают специфическим сродством к гормону или классу гормонов (например, транскортин при определении кортизола).
