Антигельминтики: фармакология и применение - Архипов И.А.
ISBN 978-585941-305-8
Скачать (прямая ссылка):
Флуоресцентная дериватизация была использована другими исследователями для анализа ивермектина в плазме с применением более современных адсорбентов и средств выделения (S.E. Marriner et al., 1987; К. Kojima et al., 1987). С разработкой более чувствительного ультрафиолетового детектора метод ВЖХ был усовершенствован для определения ивермектина в крови при чувствительности 2 нг/мл (J.V. Pivnichny et al., 1983). Метод жидкостной хроматографии и ультрафиолетового обнаружения при чувствительности 4-5 нг/мл является удобным методом для обнаружения дигидроавермектина В]а и дигидроавермектина Віб. Этот метод используется для определения препарата в молоке коров при чувствительности 2 нг/мл (М. Alvinerie et al., 1987).
Для изучения метаболизма ивермектина в организме животных N.E. Weber (1980), H.W. Dorough (1980) разработали радиометрический метод обнаружения препарата. Препарат метаболи-зируется незначительно. Основная часть препарата обнаруживается в виде основного компонента авермектина Bia (H2Bia). Концентрация этой фракции в 10-20 раз выше содержания фракции авермектина В]б (Н2Віб). В связи с этим компонент авермектина Віа является как бы маркером и основным при определении остаточных количеств ивермектина.
Наиболее точным и надежным методом изучения фармакокинетики и остаточных количеств ивермектина в продуктах животного происхождения является метод жидкостной хроматографии высокого давления (ВЖХ) с флуоресцентным детектированием после проведения дериватизации (J.A. Bogan, Q.A. McKeller, 1988; С.В. Русаков, 1997).
Принцип метода основан на извлечении препарата из анализируемых проб мяса и органов этилацетатом, отгонке растворителя, очистке экстракта в системе ацетонитрил-гексан и на концентрирующих патронах Диапак-С-16 и Диапак-Амин с последующим определением жидкостной хроматографией высокого давления с флуоресцентным детектированием после дериватизации. Чувствительность метода - 4 нг/г.
135
Реактивы и растворы: этилацетат, х.ч,; гексан, х.ч.; концентрирующие патроны Диапак-С-16 и Диапак-Амин («БиоХим-Мак»); метанол, х.ч.; 1-метилимидазол, х.ч.; стандартный раствор ивермектина в метаноле с концентрацией 0,08 мкг/мл (0,00008 мг/мл).
Приборы и посуда: жидкостной хроматограф высокого давления типа Ди Pont 8800 (США) с флуоресцентным детектором Kratos Sthaeffel FS 950 (Великобритания); вакуумный ротационный испаритель; вакуумный испаритель со смесителем Vortex; баня для охлаждения; баня водяная с подогревом; ультразвуко-войдиспергатор УЗДН-1М; ротационный испаритель; аналитические весы; плоскодонные колбы с притертой пробкой емкостью 100 мл; круглодонные колбы со шлифом емкостью 50 мл; воронки химические; пробирки с притертой пробкой емкостью 30-40 мл; пробирки конусообразные емкостью 1 мл; автоматические пипетки на 5; 1 и 0,5 мл.
Ход анализа. Пробы мышц, печени, сердца, жира, почек, легких массой по 2 г и молока и крови по 2 мл, взятые у разных групп животных по 3-5 голов в каждой до и через 2, 4, 8, 12, 16 и 20 сут после введения препарата в дозе 0,2 мг/кг измельчали ножницами или в гомогенизаторе, помещали в плоскодонную колбу емкостью 100 мл, заливали 20 мл этилацетата и оставляли на сутки (тождественно экстракции при постоянном встряхивании в течение 1 ч). Экстракт переносили через воронку с фильтровальной бумагой, заполненную на 1/3 безводным, в круглодонную колбу емкостью 50 мл. Далее пробы повторно заливали 20 мл этилацетата и экстрагировали в течение 1 ч при постоянном встряхивании. Экстракты объединяли в круглодонной колбе, после чего упаривали досуха на роторном испарителе. Сухой остаток растворяли в 10 мл ацетонитрила и переносили в делительную воронку или пробирку с притертой пробкой. Экстракт промывали 4-5 раз порциями гексана по 10 мл. Гексановые фракции отбрасывали. Ацетонитрильный экстракт переносили в круглодонную колбу емкостью 50 мл и упаривали досуха. Сухой остаток растворяли в 5 мл ацетонитрила, после чего добавляли 10 мл дистиллированной воды.
Полученную ацетонитрильно-водную фракцию (1:2) наносили на патрон Диапак-С-16, предварительно последовательно активированный 5 мл ацетонитрила и 10 мл воды. Препараты элюировали с патрона Диапак-С-16 20 мл ацетонитрила через патрон Диапак-Амин, предварительно активированный 5 мл аце-
136
тонитрила, в круглодонную колбу. Элюент упаривали досуха на роторном испарителе.
Далее сухой остаток растворяли при флуоресцентном детекторе в 1 мл ацетонитрила.
Проведение дериватизации. В пробирку с сухим остатком вносили 0,5 мл ацетонитрила, энергично встряхивали и обрабатывали ультразвуком в течение 30 с. Затем пробирку повторно встряхивали и повторно обрабатывали ультразвуком, чтобы полностью перевести в раствор авермектины, адсорбированные на стенках пробирки.
Необходимо следить, чтобы в образцы перед проведением дериватизации не попала влага.
В пробирку с подготовленным ацетонитрильным раствором после растворения вносили с помощью градуированной микропипетки 0,05 мл 1-метилимидазола. Пробирку закрывали, тщательно перемешивали содержимое в течение 5-10 с, обрабатывали ультразвуком, центрифугировали и помещали в холодильник при 0 °С на 10-15 мин. Готовили реакционную смесь из трифто-руксусного ангидрида и ацетонитрила в соотношении 1 : 2 и помещали ее в холодильник при 0 °С на 10-15 мин.
