Антигельминтики: фармакология и применение - Архипов И.А.
ISBN 978-585941-305-8
Скачать (прямая ссылка):
Настройка хроматографа. Для ввода хроматографической системы в рабочий режим колонку LUNA С 18 (250 х 4,6 мм) промывали элюентом в количестве 15 свободных объемов колонки при скорости протекания элюента 0,3 см3/мин. После окончательного уравновешивания колонки устанавливали УФ-волну анализа на 290 нм.
Приготовление рабочих стандартных растворов. На аналитических весах взвешивали по 10,0 мг (точные навески с учетом активности) фенбендазола и оксфендазола, навески переносили в общую мерную колбу объемом 100 см3, добавляли 50 см3 элюента и тщательно перемешивали до полного растворения. Затем объем раствора водой доводили до метки. Полученная концентрация исходного раствора - 100 мкг/см3 по каждому из компонентов. Из исходного раствора методом последовательных разведений готовили стандартные растворы с концентрацией 10; 5; 2,5 и 1 мкг/см3 по фенбендазолу и оксфендазолу.
Подготовка проб к аначизу. В образцы (плазма крови, печень, почки, сердце, поджелудочная железа, легкие, селезенка, мышечная ткань, жировая ткань, лимфоузлы, матка, тонкий и толстый кишечник) массой 5 г добавляли 10 см3 физиологиче-
128
ского раствора и гомогенизировали в течение 3-5 мин при 5000 об/мин.
Полученный гомогенат количественно переносили в делительную воронку и помещали в резервуар со льдом. В охлажденный гомогенат вносили 2 г бромида калия и титровали pH до 8-9 при помощи 25%-ного водного аммиака, после чего пробу тщательно перемешивали. Далее, к гомогенату добавляли 10 см' этилацетата, пробу экстрагировали при постоянном перемешивании в течение 1 ч. Затем для разделения слоев полученную эмульсию центрифугировали в течение 5 минут при 5000 об/мин. Экстракцию каждой пробы этилацетатом с последующим центрифугированием проводили трехкратно. После центрифугирования слои этилацетата переносили в круглодонную колбу для последующего упаривания. Объединенные этилацетатные экстракты упаривали досуха на ротационном испарителе при температуре +40 °С. Полученный после упаривания сухой остаток растворяли в 10 см3 ацетонитрила при одновременной обработке ультразвуком. Ацетонитрильный раствор переносили в пробирку объемом 25 см3 и промывали 3-5-кратно порциями по 8 см гексана. Гексановые фракции отбрасывали, а ацетонитрильную фракцию, промытую гексаном, переносили в круглодонную колбу объемом 50 см3 и упаривали досуха на ротационном испарителе при температуре +50°С. Полученный после упаривания сухой остаток растворяли в 0,5 см3 элюента при одновременной обработке ультразвуком для последующего анализа методом жидкостной хроматографии высокого давления.
Параметры хроматографирования. Наиболее оптимальные результаты анализа были получены при следующих хроматографических параметрах:
Обращеннофазовая хроматографическая колонка LUNA С 18 (250 х 4,6 мм) с диаметром сорбента 5 мкм. Элюент: ацетонитрил/0,05 М раствор углекислого аммония в соотношении 35/65. Скорость протекания элюента - 0,5 см3/мин. Давление: 18,4
МПа. Объем вводимой пробы - 50 мкл. Спектр УФ-волны: 290 нм.
Определение метрологических характеристик метода. Для проведения качественного и количественного анализа полученных экстрактов применяли процедуру градуировки хроматографических данных в компьютерной программе «Мультихром 1.5».
129
Для построения графика корреляции площади пика и концентрации использовали ряд стандартных разведений фенбендазола и оксфендазола 10; 5; 2,5 и 1 мкг/см , приготовленных по схеме, приведенной выше. Результаты, полученные при определении корреляции «площадь пика/концентрация» представлены в таблице 6.2.
6.2. Зависимость площади пика от концентрации
Площадь Концентрация Площадь Концентра
пика фен стандартного рас пика окс ция стандарт
бендазола твора фенбенда фендазола ного раствора
зола, мкг/см оксфендазола,
мкг/см3
914,858 10 869,341 10
912,830 854,220
474,558 5 443,089 5
464,367 1 452,101
235,690 2,5 222,013 2,5
232,999 238,608
92,721 1 85,553 1
90,640 88,269
Уравнения, полученные для линий тренда фенбендазола и оксфендазола, и в частности, величины достоверности аппроксимации (R2), приближенные к единице, свидетельствуют о высокой степени линейной зависимости площади пика от концентраций компонентов и, следовательно, о высокой достоверности получаемых результатов (рис. 6.2).
130
¦ Фенбендазол
W Оксфендазол
----Линейная
(Фенбендазол)
----Линейная
(Оксфендазол)
ю
Рис. 6.2. Калибровочный график
Определение уровня извлечения фенбендазола и оксфендазо-ла из проб. Определение уровня извлечения фенбендазола и окс-фендазола проводили на контрольных пробах. В плазму крови объемом 2 см3, а также гомогенаты проб органов и тканей массой
5 г вносили по 1 см3 стандартного раствора фенбендазола и окс-фендазола с концентрацией 5 мкг/см3. После внесения стандартных растворов пробы тщательно перемешали. Пробоподготовку проводили по отработанной методике. Объем конечных экстрактов модельных проб составлял 1 см3. Результаты определения уровней представлены в таблицах 6.3 и 6.4.
