Химия привитых поверхностных соединений - Лисичкин Г.В.
ISBN 5-9221-0342-3
Скачать (прямая ссылка):
Мы рассмотрим существующие методы получения гетероповерхностных сорбентов. В этих методах используются различные принципы получения гетероповерхностей, а именно: принцип удаления внешнего пептидного модифицирующего покрытия с помощью ферментов (метод Пинкертона) [7, 8] — геометрический принцип; принцип использования различий в скоростях реакций некоторых модификаторов с поверхностью кремнезема [10] или различий в скоростях диффузии реагентов внутрь пор — кинетико-диффузионный принцип. Кроме того, рассмотрим различные методы защиты пространства пор экраном из микрочастиц или слоем полимера [11, 12] (в этом случае также используется геометрический принцип). На рис.9.1 представлен разрез частицы гетероповерхностного сорбента.
Направление потока элюента
Макромолекулы
Молекулы низкой молекулярной массы
Внешняя поверхность, не удерживающая макромолекулы
Внутренняя поверхность, взаимодействующая с молекулами низкой молекулярной массы
Рис. 9.1. Разрез частицы пористого кремнезема с двухсортовыми гетероповерхпостями
Таким образом были получены сорбенты с гидрофильно-органофильными модифицирующими слоями или, наоборот, дифильные сорбенты с модифицированной внешней и немодифицированной внутренней поверхностями, с проницаемым экраном из привитых к поверхности или сшитых между собой микрочастиц. Этот экран защищает внутренний гидрофильный или органофильный модифицирующий слой или ионообменные группы ионообменного сорбента от контакта с большими молекулами пробы [13]. Можно также создать промежуточный сорбент с группами различной функциональности на внешней и внутренней поверхностях, которые можно изменять в желаемом направлении, модифицируя только внешние или только внутренние функциональные группы с помощью соответствующих химических реакций. Остановимся подробнее на методах получения гетероповерхностных сорбентов.
9.21
Сорбенты Пинкертона
529
Первые работы по синтезу гетероповерхностных сорбентов, полученных модифицированием по отдельности внешней или внутренней поверхности частиц пористого сорбента, появились в 1985 г. [7, 8, 10]. В этих работах были использованы геометрический [7, 8] и кинетико-диффузионный [10] принципы формирования гетероповерхностей.
9.2. Сорбенты Пинкертона
В работах [7, 8] Т. Пинкертон и Ш. Хейджестам предложили и описали способ получения сорбента для ВЭЖХ, который содержал обращенную фазу только на внутренней поверхности частиц, а внешняя поверхность являлась гидрофильной и инертной к белкам (ISRP-сорбенты). Способ получения таких сорбентов очень изящен. Первоначально всю поверхность частиц кремнезема (диаметр частиц 5 мкм, диаметр пор d„ = 8 нм) покрывали слоем глицерилпропильных [7, 14] или аминопропил-1Ч-глицидольных привитых групп (и 300 мкмоль/г) [15], затем активировали карбонилдиимидазолом [16] и модифицировали дипептидом, глицил-L-фенилаланином (Gly-L-Phe, GF), или трипептидом, глицил-Ь-фенилаланил-Ь-фенилаланином (Gly-L-Phe-L-Phe, GFF) [7, 14]. Таким образом все поверхности частиц внутри и снаружи оказывались гидрофобными, поскольку концевые фенил-аланильные группы обладают гидрофобными свойствами. После этого внешнюю поверхность обрабатывали С-концевым ферментом карбоксипептидазой А [17], которая специфически воздействовала на свободные карбоксильные группы, особенно на входящие в состав ароматических аминокислот. Фенилаланильные группы удалялись количественно, но привитые группы глицина оставались, придавая внешней поверхности гидрофильный характер. Так как молекула карбоксипептидазы А имеет массу 35000 дальтон и эффективный радиус вращения несколько больше 3 нм, то в поры диаметром менее 6 нм она проникнуть не может. Поэтому внутри пор оставалось нетронутое гидрофобное покрытие, а внешняя поверхность становилась гидрофильной. При использовании химотрипсина для расщепления амидной связи С-концевой аминокислоты с аминопропильным покрытием были также получены сорбенты с покрытиями внутри пор: 1Ч-тре7П-бутоксикарбонил-Ь-РЬе, N-бензоил-Ь-Phe и фенилпропионовой кислотой [15]. Позднее Хагинака (Haginaka) с сотр. аналогичным путем, используя полимиксинацилазу, синтезировали сорбент с внутренней аминопропил-Н-октильиой поверхностью [18]. В обоих случаях свободные амино-пропильные группы на внешней поверхности были модифицированы глицидолом для придания им большей совместимости с белками вводимых проб.
Подобный метод получения гетероповерхностного сорбента использован в работе [19]. В качестве исходного кремнезема брали силикагель КСК-2 со средним диаметром пор 12 нм, пептид глицил-L-лейцин и фермент папаин. Схема синтеза приведена на рис. 9.2.
Интересно отметить обнаруженную селективность сорбента GFF при разделении белков молекулярной массы порядка 20000. При этом времена удерживания зависят от состава элюента (pH и концентрации фосфатного буферного раствора, количества органической добавки) [20], что свидетельствует о доступности внутренней поверхности пор для молекул такого размера.
Описаные сорбенты называют «сорбентами с обращенной фазой на внутренней поверхности» (internal surface reversed-phase — ISRP) или сорбентами Пинкертона (Pinkerton) по имени автора, впервые их описавшего. Им составлено несколько
