Практический курс химической и ферментативной кинетики - Березин И.В.
Скачать (прямая ссылка):
(6.7)
где^дфф = v]\E\G* Преобразовывая выражение (6.7), получим
Из полученного выражения видно, что зависимость в координатах (1/(1 — (ёафф/йг), 1/ [S]о) при высоких концентрациях субстрата должна иметь вид прямой, из тангенса угла наклона которой и ординаты точки перееечения можно найти значения р и As'.
Существуют виды субстратного ингибирования, когда к фер-мент-субстратному комплексу присоединяется несколько молекул субстрата, переводя его в неактивное состояние. Для анализа подобных случаев разработан графический способ [1], позволяющий определить число молекул субстрата в неактивном фермент-субстратном комплексе. Если п — число дополнительных молекул субстрата, присоединившихся к фермент-субстратному комплексу, то, откладывая экспериментальные данные в координатах (1/[S]"+ [S] о/As-As', 1/а), подбирают значение п. при котором наблюдается линеаризация
1 + = V«l . _L _ 1 (6.9)
tsl» Ks Ks Ks v Ks
Для применения данного метода необходимо предварительно графически найти значение концентрации субстрата, при которой скорость ферментативной реакции достигает оптимума ([S]0ht). Из соотношения
можно найти произведения A’s-AV, соответствующие различным значениям п, и, подставляя их в выражение (6.9), произвести обработку экспериментальных данных, последовательно варьируя п.
§ 2. Активация субстратом
Случаи активации субстратом ферментативных реакций были обнаружены экспериментально лишь в последнее время (см. задачи настоящей главы). Простейшая интерпретация полученных кинетических данных может быть проведена в рамках схемы (6.5) при условии 1. Обработка экспериментальных данных в этом случае проводится так же, как и при анализе ингибирования ферментативной реакции субстратом (6.6) — (6.8). Следует лишь отме-
1-?эфф/*¦ 1-Р + 1 —Р ' [S]» ‘
(6.8)
п+1
[S]onT=VrA's-/Cs/«
(6.10)
тить, что при р>1 (схема 6.5) линеаризацию кинетических данных, соответствующих высоким концентрациям субстрата, удобно проводить в координатах
(*вфф'*,-1’
§ 3. Кинетика ферментативных реакций при условии [EJo«i[Slo. Определение абсолютной концентрации фермента из кинетических данных
Все рассмотренные в предыдущих разделах методы обработки кинетических данных относились к условиям избытка субстрата по сравнению с ферментом ([S]0 3> fE]o)- Рассмотрим теперь случай, когда концентрация субстрата сравнима по величине с концентрацией фермента ([S]o«[E]o), и выведем уравнение скорости ферментативной реакции, протекающей по двухстадийному механизму при условии быстрого установления равновесия на стадии образования фермент-субстратного комплекса
Е + S ES —- Е + Р. (6.11)
Особенностью обработки схемы (6.11) в случае [Ejo^ [S] о является необходимость использования уравнений материального баланса как по ферменту (6.12), так и по субстрату (6.13), отчего подобные системы называют иногда «системами со взаимным истощением» [2]
[E]0SfSK'[ES], (6.12)
[S]0 = [S]+[ES]. (6.13)
Подставляя в уравнение (6.12) значение [ES], найденное из обычного выражения для константы равновесия
(6-14)
и производя несложные преобразования, получим
ra-arSr (6Л5)
Комбинируя далее выражения (6.13)—(6.15), найдем
lSIo - [Щ + ^rfsj (6Л6>
Выражение (6.16) можно записать в виде квадратного уравнения
|Sf ! *JS| #sjS|(!-<\ (6.17)
где
« = Ks + [Е]0 - [S]0. (6.18)
Рещая уравнение (6.17), получим
ГС1 _а+Ka2 + 4Ks[S].
loj 2
Подставляя значение равновесной концентрации [S] в выражение (6.15), найдем значение равновесной концентрации [Е]:
[Е]
KS[E]„
1Л* + 4a:s [Si,—а
г 2
Найденные значения [S] и [Е] подставим в общее выражение для скорости ферментативной реакции
^ = *2/лг5[Е] [S],
получим
+ S-)
2KS —а + )/a2 + 4A:s[S]0 ’ ’
где Vm = /г2 [Е]0. Приводя далее выражение (6.19) к виду
1 2Кс 1
— --------7-T=J=----------------------------Г- + ~ (6.20)
и вводя в него равенство
т
получим соотношение
1
, ,=Х. (6.22)
Vmlv — 1 V 1
Из формулы (6.22) видно, что каждому значению скорости реак-
ции v соответствует определенное значение А. Таким образом, значения К соответствующие значениям [S]0, можно вычислить непосредственно из кинетических данных, если предварительно на опыте найти значение максимальной скорости реакции.
