Практический курс химической и ферментативной кинетики - Березин И.В.
Скачать (прямая ссылка):
можно показать, что в ряде случаев ингибирования наиболее эффективным методом обработки экспериментальных данных является совместный анализ графиков в координатах Диксона и Лайнуивера-Берка [5].
Приведем уравнение (5.14) к виду, удобному для анализа вариантов ингибирования в координатах (l/v, 1/[S]0) или (l/v, [I]):
1 1 + Щ laKl , KsO+Ш/К,) 1 ,ety7X
н-----; RTTTT'f^r- io.z/j
(i + Ш) v li+Щ [S]°
Очевидно, что выражение (5.27) в общем виде линеаризуется в координатах Лайнуивера-Берка и лишь в отдельных случаях в координатах Диксона, давая тем самым дополнительную возможность для подбора подходящего механизма, описывающего изучаемую ферментативную реакцию. Рассмотрим некоторые частные случаи схемы (5.13), приводящие к нетривиальным типам ингибирования.
1) р = 0. В этом случае вид графика в координатах Лайнуивера-Берка иллюстрирует классическое смешанное ингибирование или (при а->-оо) полное конкурентное ингибирование. Независимо от численного значения а абсцисса точки пересечения пучка прямых в координатах Диксона равна — Ki (см. рис. 46) и ордината равна (1 — 1/а)/Vm- Отсюда видно, что в зависимости от величины а общая точка пересечения прямых в координатах Диксона может находиться в левом верхнем квадранте (а>1, смешанное или конкурентное ингибирование), на оси абсцисс (а — 1) или в левом нижнем квадранте (а<1). Во всех этих случаях величина Ki обычно определяется с хорошей точностью (как абсцисса общей точки пересечения).
2) р = 1. Этот вид ингибирования называется псевдоконкурент-ным, так как из следующего выражения видно, что характер графика в координатах Лайнуивера-Берка идентичен случаю классического конкурентного ингибирования:
1 J___i_ s V . 1 /5 28)
— 1/ "Г / Г11 \ ГЯ1 • (O.ZOJ
Так как выражение (5.28) не линеаризуется в координатах Диксона, сопоставление обоих типов графиков позволяет отличить псевдоконкурентное ингибирование от обычного конкурентного.
3) р = 0; Ki = сю. Этот тип ингибирования называется антиконкурентным, так как ингибитор связывается только с фермент-субстратным комплексом и не взаимодействует со свободным ферментом. В этом случае график в координатах Лайнуивера-Берка имеет вид семейства параллельных прямых и неотличим от случая бесконкурентного ингибирования (где а = р, см. раз-
дел 3). Однако зависимости в координатах Диксона в случае
V
(5.29)
антиконкурентного ингибирования имеют вид параллельных прямых (с тангенсом угла наклона, равным 1/aKiVm), в отличие от гиперболических кривых в случае бесконкурентного ингибирования:
4) а = р. В случае бесконкурентного ингибирования (5.30) зависимости в координатах Диксона являются гиперболическими и перестают зависеть от концентрации ингибитора при [I]//(i> > 1 < [I]/a/Ci, приводя к лимитирующей величине l/v, равной l/ym(l/a+/Cs[5]0), откуда можно найти значение а.
Таким образом, совместное применение координат Лайнуивера-Берка и Диксона позволяет выявить некоторые варианты нетривиальных типов ингибирования.
§ 4. Кинетический метод двухкомпонентного обратимого ингибирования ферментативных реакций
Важную информацию о строении активного центра фермента можно получить с помощью метода двухкомпонентного обратимого ингибирования [6]. Для этого вводится понятие о взаимонезависи-мых и взаимозависимых ингибиторах. По определению, взаимо-независимые ингибиторы могут одновременно (и независимо) связываться с активным центром фермента, в то время как для взаимозависимых ингибиторов это исключено.
а. Влияние взаимозависимых конкурентных ингибиторов на кинетические параметры ферментативной реакции. Схема двухстадийной ферментативной реакции в присутствии двух взаимозависимых конкурентных ингибиторов выглядит следующим образом:
V
(5.30)
E + ST^ES^E + P.
(5.31)
Кинетическая обработка схемы (5.31), проводимая обычным способом (по методу установившегося равновесия или по методу стационарных концентраций), приводит к выражению (5.7) для начальной скорости ферментативной реакции, где
К* = К (5.32)
Кт(к&ж) = Ks 11 j - (5.33)
Графически зависимость (5.33) можно представить в координатах (Кт(каж), [Ii]) прямой линией (при [I2] = const), тангенс угла наклона которой равен отношению KslKi, а отрезок, отсекаемый на оси ординат, равен Ks{ 1 + [12]/Кг') (рис. 34). Таким образом, зная значение Ks из опытов, проведенных в отсутствие ингибиторов, можно определить величины Кх и Кг.
Рис. 34. Зависимость кажущейся константы Михаэлиса от концентрации ингибитора [I,] (при [I2] = const) в присутствии двух взаимозависимых конкурентных ингибиторов
Рис. 35. Зависимость кажущейся константы Михаэлиса от концентрации ингибитора [Ii] (при [I2] = const) в присутствии двух взаимонезавнсимых конкурентных ингибиторов
