Практический курс химической и ферментативной кинетики - Березин И.В.
Скачать (прямая ссылка):
1. Полное конкурентное ингибирование (а->оо, р не имеет определенного смысла). В случае полного конкурентного ингибирования начальная скорость ферментативной реакции определяется выражением
® =/ГТ----------------- (5-15)
1 + ~К\) + [S]o
и зависимость в координатах Лайнуивера-Берка имеет вид пучка прямых, пересекающихся на оси ординат (см. рис. 38). Константу конкурентного ингибирования Кг можно определить с помощью выражения
/Cm(KB*, = /Csfl + -P-), (5.16)
откладывая экспериментальные данные в координатах (К-щквж), [I]).
Для определения константы ингибирования распространен также так называемый метод Диксона, согласно которому экспериментальные данные откладывают в координатах (1/a, [I]) (см. рис. 46).
2. Полное неконкурентное ингибирование (а = 1, Р = 0).
В случае полного неконкурентного ингибирования выражение для начальной скорости ферментативной реакции имеет вид
1 + [1 М, [EUS]o /С17Ч
V /Cs + [S]. ’ ( ^
и зависимость в координатах Лайнуивера-Берка имеет вид пучка прямых, пересекающихся на оси абсцисс (см. рис. 39). Константу неконкурентного ингибирования можно определять с помощью выражения
^Kai = 1 + [1]//<, (5.18)
построением экспериментальных данных в координатах (1/Акат, [I])» или с помощью метода Диксона (см. рис. 41).
3. Бесконкурентное ингибирование (а=р< 1). В случае бесконкурентного типа ингибирования константы &кат и Кт<.кэ.ж) ферментативной реакции уменьшаются в одинаковой степени (5.19), так что график соответствующей зависимости в координатах Лайнуивера-Берка имеет вид семейства параллельных прямых (см. рис. 44):
Ki + [I]
“*¦ -к, + [I]|EUS1,
-----/сР+Ti]--------' (5Л9)
aKSaKl + [I] +
Для анализа уравнения (5.19) выражение
и , ^ I + [I] ,к огл
^кат а^2 _j_ jjj (5.z0)
можно преобразовать к виду
1 1 +S-HT. (в-21)
^катМг ^ а 1 а 1 [I]
из которого видно, что линеаризация экспериментальных данных в координатах ^1 j k~r ¦ — 1,1/[1]^ позволяет раздельно найти значения а и К\.
4. Неконкурентная активация (а = 1, |3> 1). В случае неконкурентной активации субстрат и активатор связываются независимо с активным центром, образуя тройной комплекс (фермент-субстрат-активатор) и приводя к увеличению скорости образования продукта, так что начальная скорость ферментативной реакции определяется выражением
/СА + р [А]
*¦ *:.,¦! [А| га-и.
------KTHSS----------' <5^>
и зависимость в координатах Лайнуивера-Берка имеет вид пучка лрямых, пересекающихся на оси абсцисс (см. рис. 48). Анализ уравнения (5.22) можно проводить с помощью выражения
<5-23)
преобразованного в виде
1 1 (5-24)
Акат - Р-1 ^ Р-1 ГА] *
А.
Из выражения (5.24) видно, что построение графика в координа-
k
тах (1/—-------1, 1/[А]) позволяет провести раздельное опреде-
ление констант р и Ка-
5. Смешанные типы ингибирования и активации (а Ф\,
§Ф 1). В случае смешанных типов ингибирования или активации графики в координатах Лайнуивера-Берка имеют вид пучка прямых, соответствующих различным концентрациям эффектора и пересекающихся в общей точке в правом верхнем, левом верхнем или левом нижнем квадранте (в зависимости от числовых значений а и р и соотношения между ними). Координаты точки пересечения во всех случаях являются следующими [4}:
йг-*г^т- (5-25)
— = rj- ^4 . (5.26)
v Vm а —$ v '
Из выражений (5.25) и (5.26) видно, что положение точки, в ко-
торой происходит пересечение пучка прямых зависимости I/o от 1/[S] о при различных концентрациях эффектора, определяется лишь значениями констант а и р и не зависит от величины Ка (см. 5.13). Таким образом, вид графика в координатах Лайнуиве-ра-Берка может быть использован для определения типа влияния эффектора на ферментативную реакцию и для оценки интервалов значений аир [4].
6. Применение метода Диксона к анализу нетривиальных типов
ингибирования. Как отмечалось выше, обработка данных по влиянию ингибиторов на кинетику ферментативных реакций может
быть проведена в координатах Лайнуивера-Берка (l/v, 1/[S]0) или, согласно методу Диксона, в координатах (1/и, [I]). Метод Диксона обладает тем преимуществом, что он позволяет определять значение константы ингибирования непосредственно из кинетических данных, не прибегая к дополнительным построениям. С другой стороны, вид графика в координатах Диксона не позволяет отличить смешанный тин ингибирования от конкурентного или неконкурентного ингибирования, как это обычно можно сделать при построении в координатах Лайнуивера-Берка. Однако
